1.3.2  頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

　　參照葉韜等1211的研究方法，萃取頭于氣相色譜儀進(jìn)樣口活化1h（270℃），分別精確稱(chēng)取2.0g切割為2mm左右的樣品及擠壓原料于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，加入1uL的2，4，6-三甲基吡啶（2，4，6-trimethylpyridine，TMP）標(biāo)準(zhǔn)品，密封，插入自動(dòng)頂空進(jìn)樣器，調(diào)節(jié)溫度為90℃，解吸3min。色譜條件：色譜柱DB-5MS（30m×0.25mm，0.25um），柱流量1mL/min，進(jìn)口溫度250℃，調(diào)節(jié)起始溫度為40℃，停留2min；升溫速率6℃/min，升至120℃，停留5min；升溫速率8℃/min，升至200℃，停留2min；升溫速率10℃/min，升至250℃，停留8min。質(zhì)譜條件：接口溫度250℃，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，電離方式為電子電離，電子能量70eV，質(zhì)量掃描范圍45～450amu/s。以匹配度大于80的化合物進(jìn)行質(zhì)譜定性，以揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰面積與TMP峰面積的比值進(jìn)行定量，擠壓樣品中各揮發(fā)性物質(zhì)保留率按下式計(jì)算。
       

　　1.3.3  掃描電子顯微鏡觀(guān)察

　　參照孫志欣的方法，將仿肉樣品切片（厚1mm、寬4mm、長(zhǎng)4mm），用體積分?jǐn)?shù)2.5%、pH6.8的戊二醛固定（4℃、1.5h），0.1mol/LpH6.8的磷酸鹽緩沖溶液沖洗（2次、10min/次），體積分?jǐn)?shù)50%、70%、90%乙醇溶液各脫水10min，100%乙醇脫水兩次（每次10min），100%乙醇與叔丁醇混合溶液（1：1，V/V）脫水15min，叔丁醇脫水15min（室溫高于25℃下操作），冷凍干燥4h，樣品觀(guān)察面向上粘于掃描電子顯微鏡樣品臺(tái)，鍍金（厚度1500nm），將鍍金后的樣品放入掃描電子顯微鏡觀(guān)察（放大倍數(shù)為500）。

　　1.3.4  核磁共振分析

　　將擠壓樣品切條置于直徑25mm的核磁管中（布滿(mǎn)至核磁管高度的1/3處，盡量不留空隙），參照李騰的掃描參數(shù)，用CPMG序列測(cè)量橫向弛豫時(shí)間T2，各樣品重復(fù)測(cè)量3次，保存數(shù)據(jù)，記錄T2b、T12，和T22。

　　1.3.5  傅里葉變換紅外光譜分析

　　參考和陳鋒亮Beck等的研究方法，將真空冷凍干燥的樣品粉碎，在紅外燈下研磨后取樣（2mg），并混入200mg溴化鉀純品于瑪瑙研缽中，研磨約15min后進(jìn)行壓片（壓力14kg、時(shí)間1min），將樣品片放入傅里葉變換紅外光譜儀中掃描。掃描條件：光譜掃描范圍400～4000cm-1，分辨率4cm-1，信號(hào)掃描累加64次。利用分峰軟件PeakFit 4.0進(jìn)行圖譜處理。

　　每組實(shí)驗(yàn)都進(jìn)行3次平行，并將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS18對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性（Pearson相關(guān)系數(shù)法）和顯著性分析（方差分析，P＜0.05為差異顯著）；采用Origin8.5軟件進(jìn)行作圖；數(shù)據(jù)及方差分析利用Design-Expert軟件進(jìn)行。

　　注：同行肩標(biāo)小寫(xiě)字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；1～4.分別表示螺桿轉(zhuǎn)速為200、250、300、350r/min的擠壓樣品。表2、3同。

　　由表1可知，仿肉制品中各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總保留率及烯類(lèi)、酚類(lèi)、醛類(lèi)、醇類(lèi)、酯類(lèi)及烷烴類(lèi)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)保留率隨螺桿轉(zhuǎn)速的增加均有先增多后減少的變化趨勢(shì)，且在300r/min時(shí)最大。上述保留率變化的原因可能與擠壓過(guò)程中蛋白結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，一定程度上增加螺桿轉(zhuǎn)速，導(dǎo)致擠壓過(guò)程中蛋白對(duì)部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的吸附能力增強(qiáng)，在仿肉制品擠出時(shí)，受水分蒸發(fā)影響較小，導(dǎo)致保留率較大；而隨著螺桿轉(zhuǎn)速的繼續(xù)增加，物料在機(jī)筒的滯留時(shí)間縮短，與蛋白的吸附時(shí)間相應(yīng)縮短，且較高的轉(zhuǎn)速也可能破壞β-環(huán)狀糊精膠囊，導(dǎo)致更多的風(fēng)味物質(zhì)流出，在物料擠出時(shí)，隨擠出物中部分水分的蒸發(fā)而損失，導(dǎo)致其保留率較低。不同揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保留率有較大差異，保留率最高達(dá)到92.88%（茴香腦），最低為0（3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、桉樹(shù)醇），而與其他類(lèi)型相比，醇類(lèi)及醛類(lèi)的保留率相對(duì)較小，原因可能與風(fēng)味物質(zhì)的物理化學(xué)特性有關(guān)，擠壓過(guò)程中蛋白與其結(jié)合，檢測(cè)過(guò)程中風(fēng)味無(wú)法釋放，導(dǎo)致保留率較小。其中3，7-二甲基-1，3，6-辛三烯、桉樹(shù)醇的保留率較?。ㄗ畹蜑?%），原因可能是原料中這兩種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量較少，且在擠壓過(guò)程中損失嚴(yán)重，導(dǎo)致剩余含量較少而難以檢測(cè)到。

　　由圖1、2可知，螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)仿肉制品的微觀(guān)結(jié)構(gòu)影響較大，200～250r/min時(shí)，仿肉制品的微觀(guān)結(jié)構(gòu)較緊密，增加至300r/min時(shí)，仿肉制品內(nèi)部出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，繼續(xù)增加螺桿轉(zhuǎn)速，仿肉制品內(nèi)部出現(xiàn)空洞。上述微觀(guān)結(jié)構(gòu)的變化可能與物料在擠壓過(guò)程中化學(xué)鍵變化及蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，螺桿轉(zhuǎn)速增加，增強(qiáng)了螺桿對(duì)物料的剪切力及物料與機(jī)筒的摩擦力，蛋白在擠壓過(guò)程中變性程度增加，黏性降低，在高強(qiáng)度剪切力下，內(nèi)部出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，且轉(zhuǎn)速過(guò)高，物料在擠出時(shí)部分膨化，產(chǎn)生管狀氣腔結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)圖1d和圖2d中的空洞。

表2  螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)仿肉制品互的影響

　　由圖3及表2可知，隨螺桿轉(zhuǎn)速的增加，仿肉制品T2b先增大后減小，250r/min時(shí)，T2b最大。由Bosmans和LiTeng等的研究結(jié)果可知，弛豫時(shí)間短于1ms的組分主要為蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)中不可交換的CH質(zhì)子，其埋藏于分子內(nèi)部，較難接觸外部水分子，自由度較低；而上述結(jié)果變化的原因可能是螺桿轉(zhuǎn)速的提高，增加了擠壓物料的混合速度，促進(jìn)熱量傳遞并形成較多摩擦熱，導(dǎo)致蛋白在擠壓過(guò)程中變性嚴(yán)重，損失部分CH質(zhì)子，減弱蛋白內(nèi)部與水分子間的相互作用，導(dǎo)致T2b增大。而繼續(xù)增加螺桿轉(zhuǎn)速，較高的剪切力可能促進(jìn)水分進(jìn)入蛋白內(nèi)部，增強(qiáng)蛋白與水分子間的相互作用，水分子運(yùn)動(dòng)自由度降低，導(dǎo)致T2b減小。

　　由表2中T21的變化趨勢(shì)可知，隨螺桿轉(zhuǎn)速的增加，T21有先增大后減小的變化趨勢(shì)，且250r/min時(shí)，其仿肉制品T21有最大值4.76ms。由Ruan等的研究結(jié)果可知，T21對(duì)應(yīng)水分在仿肉制品中大分子間轉(zhuǎn)移和水分子與蛋白大分子間氫鍵變化的弛豫時(shí)間，結(jié)合上述結(jié)果說(shuō)明，一定程度上加快螺桿轉(zhuǎn)速可增加水分子的運(yùn)動(dòng)性，原因可能是螺桿轉(zhuǎn)速增加，蛋白變性程度增強(qiáng)，內(nèi)部疏水基團(tuán)較親水基團(tuán)暴露更多，疏水作用較強(qiáng)（可能影響部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的吸附，導(dǎo)致水分子間的相互作用較蛋白與水分子間的強(qiáng)烈，水分轉(zhuǎn)移更自由，T21增大；而繼續(xù)加快螺桿轉(zhuǎn)速，親水基團(tuán)暴露較多，蛋白與水分子間形成氫鍵，導(dǎo)致水分轉(zhuǎn)移較困難，T21減小。

　　由表2中T22的變化趨勢(shì)可知，螺桿轉(zhuǎn)速由200r/min增加到250r/min時(shí)，T22不變；由250r/min增加到300r/min時(shí)，T22增大，且繼續(xù)增加螺桿轉(zhuǎn)速，T22不變。推測(cè)T22對(duì)應(yīng)的主要為仿肉制品內(nèi)部較大空隙及裂縫中的水分子運(yùn)動(dòng)弛豫時(shí)間，該部分水分子運(yùn)動(dòng)自由度高，對(duì)應(yīng)T22值較大。結(jié)合2.2節(jié)顯微結(jié)構(gòu)分析可知，螺桿轉(zhuǎn)速增加300r/min，物料在擠出時(shí)受到的剪切強(qiáng)度增大，仿肉制品內(nèi)部出現(xiàn)斷裂及膨化現(xiàn)象，T22對(duì)應(yīng)水分轉(zhuǎn)移較自由，導(dǎo)致T22增大。

　　2.4  大豆分離蛋白仿肉制品蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

　　由圖4可知，與擠壓原料相比，仿肉制品在3300～3500cm-1范圍O—H及N—H鍵的伸縮振動(dòng)吸收總體減弱，但隨著螺桿轉(zhuǎn)速的增加變化不規(guī)律，其中在300r/min時(shí)的振動(dòng)吸收最強(qiáng)，且比原料的振動(dòng)吸收強(qiáng)，說(shuō)明蛋白質(zhì)與水分子的O—H基團(tuán)、氨基酸的C=0基團(tuán)之間分子內(nèi)、分子間氫鍵較強(qiáng)，推測(cè)該結(jié)果與部分親水基團(tuán)形成氫鍵有關(guān)。而與擠壓原料相比，仿肉制品在2200～2400cm-1范圍伸縮振動(dòng)吸收增強(qiáng)，且隨著螺桿轉(zhuǎn)速的增加，振動(dòng)吸收先增強(qiáng)后減弱，其中在250r/min的振動(dòng)吸收最強(qiáng)，該部分主要是—CH2變形振動(dòng)及C—H鍵伸縮振動(dòng)，其吸收峰強(qiáng)度的變化可能與氫鍵的形成及蛋白與某些風(fēng)味成分的結(jié)合有關(guān)。1600～1700cm-1范圍稱(chēng)為酰胺I帶，由該波長(zhǎng)范圍通過(guò)PeakFit 4.0軟件進(jìn)行基線(xiàn)校正、去卷積、二階導(dǎo)數(shù)擬合，得到各二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量（表2）。其中β1為β-反向平行折疊片層，由分子間強(qiáng)相互作用氫鍵維持；β2由分子間非平面弱氫鍵維持；β-折疊及α-螺旋由分子內(nèi)相互作用氫鍵維持；β-轉(zhuǎn)角為松散有序結(jié)構(gòu)，含量最高；y-無(wú)規(guī)卷曲由C=O與水形成的氫鍵維持。

表3  不同螺桿轉(zhuǎn)速仿肉制品蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量

　　注：β1.β-反向平行折疊片層；β2.由分子間平面弱氫鍵維持（偶極子轉(zhuǎn)換相互作用）；1.波數(shù)不連續(xù)。

　　由表3可知，仿肉制品主要由松散有序結(jié)構(gòu)（β-轉(zhuǎn)角，相對(duì)含量約25%）與緊密有序結(jié)構(gòu)（α-螺旋+β-折疊，40%左右）組成，α-螺旋+β-折疊相對(duì)含量較β1+β2高，說(shuō)明仿肉制品分子內(nèi)氫鍵相互作用較強(qiáng)。隨螺桿轉(zhuǎn)速的增加，仿肉制品中β1和β2相對(duì)含量先增加后減少，各擠壓處理組β1相對(duì)較擠壓原料少，其中在250 t/min時(shí)，β1和β2相對(duì)含量最高，且β2較擠壓原料相對(duì)含量高；由劉燕琪等的研究表明，由分子間親水側(cè)鏈強(qiáng)氫鍵維持，其相對(duì)含量較高，可能蛋白親水基團(tuán)含量較多，蛋白親水水合作用較強(qiáng)，β2由分子間非平面弱氫鍵維持，上述結(jié)果說(shuō)明在一定程度上增加螺桿轉(zhuǎn)速，可增加仿肉制品的分子間弱氫鍵含量。β1+β2二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量主要表征蛋白分子間氫鍵作用，由表3可知，β1+β2相對(duì)含量隨螺桿轉(zhuǎn)速的增加先增加后減少，且在250r/min時(shí)含量最高，表明在該轉(zhuǎn)速下，仿肉制品中分子間氫鍵作用最強(qiáng)，蛋白聚集增多，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)更為緊密，可能利于對(duì)部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保持。β-轉(zhuǎn)角的相對(duì)含量隨螺桿轉(zhuǎn)速的增加而增多，α-螺旋+β-折疊相對(duì)含量呈先減少后增多的變化趨勢(shì)，且在300 r/min時(shí)的相對(duì)含量最少，說(shuō)明在一定程度上螺桿轉(zhuǎn)速的增加，可減少仿肉制品中緊密有序結(jié)構(gòu)的含量，增加松散有序結(jié)構(gòu)，有利于蛋白在擠壓過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化，易于形成纖維狀仿肉制品及部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的吸附，y-無(wú)規(guī)卷曲相對(duì)含量隨螺桿轉(zhuǎn)速的增加有先增多后減少的變化趨勢(shì)，且在300 r/min時(shí)最多，可能與β1、β2向y-無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變有關(guān)，說(shuō)明在一定程度上增加螺桿轉(zhuǎn)速，C=O與水分子的氫鍵作用增強(qiáng)，進(jìn)而影響T2b的變化趨勢(shì)；且由王辰等的研究可知-無(wú)規(guī)卷曲含量與表面疏水性呈正相關(guān)，說(shuō)明在一定程度上增加螺桿轉(zhuǎn)速，可能引起擠壓過(guò)程中部分疏水基團(tuán)暴露，增強(qiáng)疏水相互作用及疏水水合作用，可能導(dǎo)致擠壓過(guò)程中蛋白對(duì)風(fēng)味物質(zhì)的吸附力增強(qiáng)，繼而提高揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保留率。

　　本實(shí)驗(yàn)研究了螺桿轉(zhuǎn)速對(duì)持香型大豆分離蛋白仿肉制品微觀(guān)結(jié)構(gòu)、水分分布、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)保留率的影響。結(jié)果表明一定程度上增加螺桿轉(zhuǎn)速，可產(chǎn)生較為緊密的仿肉制品微觀(guān)結(jié)構(gòu)，減弱水分子的運(yùn)動(dòng)自由度，減少α-螺旋和β-折疊緊密結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量，使蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，上述結(jié)構(gòu)變化有利于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保持，原因可能是緊密的仿肉制品結(jié)構(gòu)導(dǎo)致風(fēng)味物質(zhì)擴(kuò)散速度減慢；水分子運(yùn)動(dòng)自由度減弱可側(cè)面反映風(fēng)味物質(zhì)的擴(kuò)散速率，其自由度低，風(fēng)味擴(kuò)散較慢；另外二級(jí)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)（柔性增加）、蛋白氫鍵及疏水基團(tuán)的增多可能促進(jìn)部分風(fēng)味物質(zhì)與蛋白發(fā)生可逆性結(jié)合，在頂空氣相色譜-質(zhì)譜分析過(guò)程中升溫導(dǎo)致這部分風(fēng)味物質(zhì)釋放，造成風(fēng)味物質(zhì)保留量增多。