摘要：為探究槲皮素對冷藏豬肉糜氧化及品質特性的影響，將不同添加量（0、0.05、0.10g/kg和0.20g/kg）的槲皮素添加到肉糜中，對硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acids reactive substances，TBARS）值、蛋白總巰基含量、蛋白羰基含量、表面疏水性以及肉糜的色澤、蒸煮損失和質構特性進行測定。結果表明：各個添加量的槲皮素均能顯著降低肉糜的TBARS值（P＜0.05）；在貯藏第9天，槲皮素添加量為0.10g/kg和0.20g/kg時，蛋白質巰基損失和表面疏水性增加均受到了明顯抑制；在貯藏第1～6天，槲皮素添加量為0.20g/kg時，顯著抑制了羰基化合物的生成（P＜0.05）；槲皮素添加量為0.10g/kg時，能有效提高肉糜的紅度；在貯藏第6天和第9天，槲皮素添加量為0.05g/kg和0.10g/kg時，蒸煮損失率顯著降低（P＜0.05）；槲皮素能顯著提高肉糜在貯藏過程中的彈性、硬度和咀嚼度（P＜0.05）。因此，以槲皮素為抗氧化劑抑制肉及肉制品氧化時，應考慮添加量對肉品品質的影響。

　　關鍵詞：槲皮素；冷藏豬肉糜；脂肪氧化；蛋白質氧化；品質特性

　　脂肪氧化和蛋白質氧化是除微生物污染外對肉及肉制品品質影響最大的兩個因素，二者都是由復雜的自由基鏈式反應引發(fā)的。通常，脂肪氧化多發(fā)生于不飽和脂肪酸，環(huán)境中存在的自由基和氧化物與不飽和脂肪酸反應生成過氧化物，過氧化物再最終裂解成醛、酮、酸等小分子物質；而蛋白質氧化主要是由自由基和氧化物直接作用于蛋白質的氨基酸側鏈造成的，最終導致多肽鏈斷裂、側鏈氨基酸氧化修飾以及蛋白質交聯。因此，脂肪氧化和蛋白質氧化會引起脂類和蛋白質降解，二者同時發(fā)生并相互影響，對肉及肉制品的營養(yǎng)價值、功能特性和感官品質產生不良影響。因此，為了防止肉制品變質以及變質所帶來的危害，抑制肌肉中脂肪氧化和蛋白氧化是非常重要的。通常在肉制品加工和流通環(huán)節(jié)中采用真空包裝等物理措施，此外，添加適量安全、高效的抗氧化劑也是一種有效的方法。目前國內外廣泛使用的抗氧化劑多為化學合成物質，但已有研究顯示，化學合成抗氧化劑存在一定的安全風險，部分合成抗氧化劑對人體有一定的負面影響；因此，尋找更加有效、安全的天然抗氧化劑一直是肉制品領域的研究主題。

　　槲皮素化學名為3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮，屬于黃酮醇類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果、中草藥等植物中。槲皮素由黃酮類化合物2-苯基色原酮衍生而來，酚苯環(huán)結構中有5個酚羥基基團，其中C環(huán)上的3-羥基-4-酮、5-羥基-4-酮和B環(huán)上的3’,4’-二羥基結構使槲皮素分子有超高離域共軛體系、超強配位能力氧原子和獨特空間構型，極易與Mg2+、Fe2+、Cu2+金屬離子發(fā)生螯合作用，形成復雜的螯合物。其結構特性賦予槲皮素抗氧化、抗菌消炎、抗腫瘤、抗細胞凋亡等多種生物活性。已有研究表明，槲皮素能抑制肌原纖維蛋白乳化體系中脂肪的氧化，并能減少蛋白質羰基氧化產物的形成，如α-氨基己二酸半醛、α-氨基己二酸、γ-谷氨酸半醛。但是總體來看，槲皮素作為抗氧化劑在肉品中的應用還缺乏相關的基礎研究。此外，在研究槲皮素抑制肉品氧化作用的同時，還有必要考慮其對肉品品質的影響，因為已有研究證實，多酚類物質在高濃度下能夠降低肌原纖維蛋白的功能特性。因此，本實驗以槲皮素為抗氧化劑，探究其對冷藏豬肉糜脂肪和蛋白氧化的抑制效果，同時研究其對肉糜色澤、蒸煮損失和質構特性的影響，為槲皮素在肉品中的應用提供理論依據。

　　1  材料與方法

　　豬背最長肌、肥膘，購于當地超市。

　　丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）；槲皮素。氯化鎂、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯仿、甲醇、氯化鈉等試劑均為國產分析純。

　　1.2  儀器與設備

　　Allegra 64R冷凍離心機；FE20pH計、PL203型電子分析天平；T25數顯型均質機；UV2550紫外-可見光分光光度計；TA-XT2i質構儀；CR-400色差儀。

　　1.3  方法

　　1.3.1  肉糜制作和蛋白質提取方法

　　1.3.1.1  肉糜制作

　　肉糜的制備在4℃冷庫中進行。配方為：70%（質量分數，下同）豬背最長肌、10%肥膘、18%水和2%氯化鈉。將豬肉用絞肉機絞碎后，分為5個處理組：第1組為空白組（即不添加任何抗氧化劑）；第2～4組分別添加0.05、0.10、0.20g/kg槲皮素，第5組添加0.2g/kgBHA。將0.025、0.050、0.100g槲皮素和0.10gBHA分別用2mL體積分數95%的乙醇溶液溶解后，再加到肉糜中，肉糜總質量為500g。充分混合均勻后，將肉糜制成50g的肉餅，直徑約7cm，厚度約1cm，每3個肉餅放入一個聚丙烯包裝盒中，用保鮮膜封好，置于4℃冰箱冷藏，分別在第1、3、6、9天測定各項指標。

　　1.3.1.2  蛋白質的提取與濃度的測定

　　肌原纖維蛋白提取按照Park等的方法進行。稱取適量肉糜加入4倍體積的4℃提取液（10mmol/L磷酸緩沖溶液，含100mmol/L NaCl、2mmol/L MgCl2和1mmol/L二胺四乙酸，pH7.0），勻漿60s，離心15min（3500 r/min、4℃）。取沉淀，重復提取兩次。去上清液，用4倍體積4℃100mmol/L NaCl溶液重復清洗3次。最終用4層紗布過濾，用0.1mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至6.0，然后再冷凍離心15min（3500r/min、4℃），去上清液。稱質量后4℃條件下冷藏。蛋白質濃度用雙縮脲法測定，牛血清白蛋白作為標準蛋白。

　　1.3.2  硫代巴比妥酸反應產物值的測定

　　硫代巴比妥酸反應產物（thiobarbituric acids reactive substances，TBARS）值的測定參照Jongberg等的方法，并做適當修改。準確稱取絞碎的豬肉糜5g，加入15mL75g/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-1g/L焦性沒食子酸-1g/L乙二胺四乙酸混合溶液，然后11000r/min均質60s，4℃冷凍離心5min（3500r/min），過濾后取濾液，加2.5mL0.02mol/L硫代巴比妥酸溶液于裝有2.5mL濾液的試管中，然后沸水浴反應50min顯色，冷卻后在532nm波長處測定吸光度（A）。TBARS值以每千克肉樣品中所含的丙二醛質量表示，計算如式（1）所示。

　　（1）

　　式中：V 表示樣品體積/mL；M表示丙二醛的摩爾質量（72.063g/mo l）；ε表示摩爾吸光系數（156000L/（mol·cm））；I表示光程（1cm）；m表示肉樣質量/kg。

　　1.3.3  總巰基含量的測定

　　總巰基含量的測定按照Yang Hua等的方法并加以修改。將蛋白溶液稀釋成5mg/mL，取1mL加入8mL Tris-甘氨酸溶液，均質后，冷凍離心15min（10 000 r/min、4℃），除去不溶性蛋白。取4.5mL上清液，加入0.5mL Ellman試劑，混勻，在室溫下避光放置30min后，在412nm波長處測定吸光度。使用摩爾吸光系數13600L/（mol·cm）計算蛋白中總巰基的含量。

　　1.3.4  羰基含量的測定

　　參考Ortu?o等的方法測定羰基含量，并略加修改。將蛋白質溶液稀釋成5mg/mL，向3mL蛋白溶液中加入1mL10mmol/L二硝基苯肼溶液，在室溫下靜置1h（每15min振蕩一次），然后添加1mL20%TCA溶液，冷凍離心5min（10000r/min，4℃），取沉淀，用乙酸乙酯-乙醇（體積比1∶1）洗滌沉淀3次以除去未反應的試劑，加入3mL6mol/L鹽酸胍溶液在37℃下溶解蛋白沉淀，然后冷凍離心5min（10000r/min，4℃）去除不溶物，所得的溶液在370nm波長處測定吸光度。空白組則是加入1mL 2mol/L HCl溶液。使用摩爾吸光系數22000L/（mol·cm）計算蛋白中羰基含量。

　　1.3.5  表面疏水性的測定

　　參照Chelh等的方法，取1mL 5mg/mL的蛋白溶液，加入200μL的1mg/mL溴酚藍，混勻，室溫下振蕩10min，然后離心15min（4℃、6000r/min），取上清液稀釋10倍，在595nm波長處測定吸光度，對照組為磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）替代蛋白溶液。表面疏水性可用溴酚藍結合量表征，具體計算見公式（2）。

　　（2）

　　1.3.6  肉糜顏色的測定

　　使用手持色差儀測定肉糜顏色，先將色差儀進行校正，將肉樣放置于自然光充足的平面上，垂直將色差儀置于肉糜上方，鏡面緊扣肉面（不漏光），隨機在每個樣品3個不同的位置測定數據，分別得到L*、a*和b*值，將3次測量值的平均數作為色差讀數，重復3次。

　　1.3.7  肉糜蒸煮損失率的測定

　　準確稱取質量為m1（30～35g）的均勻肉糜，填裝到50mL塑料離心管中，然后低速離心（1500r/min、4℃、5min）除氣泡，然后將肉樣置于85℃水浴鍋中，沒過肉樣蒸煮30min，蒸煮后冷卻至室溫，用濾紙吸干水分，然后稱肉糜質量，記為m2/g。稱完后，放在4℃環(huán)境中保存。蒸煮損失率計算按公式（3）進行。

　　（3）

　　1.3.8  熟肉糜的質構分析

　　將煮熟的肉糜切成直徑2cm、高度1cm的柱狀樣品。質構儀參數設定為：P50鋁合金探頭、測前速率2mm/s、測中速率1mm/s、測后速率1mm/s、間隔時間5s、觸發(fā)力5.0kg。每組6個平行，重復3次。

　　每個實驗重復3次，結果表示為平均值±標準差。數據統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件中的Linear Models程序進行處理，差異顯著性分析采用LSD程序，P＜0.05表示差異顯著。作圖使用SigmaPlot12.5軟件。

　　同一添加組、不同貯藏時間小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；

　　同一貯藏時間、不同添加組大寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

　　硫代巴比妥酸實驗是目前應用于監(jiān)測含油脂食品氧化酸敗最廣泛的方法之一。如圖1所示，各組肉糜的TBARS值在冷藏過程中整體呈上升趨勢，尤其是空白組，脂肪氧化程度大幅度增加，在第6天和9天時急劇升高，這可能是氧化后期初級氧化產物氫過氧化物大量裂解為醛、醇、酮等小分子氧化產物所致。添加槲皮素后，各組的TBARS值均顯著低于空白組（P＜0.05），這可能是因為槲皮素結構中B環(huán)上的3’,4’-OH基團具有較強的清除自由基的能力，能夠清除不飽和脂肪酸的游離基，從而阻止其生成過氧化物，有效避免了脂肪氧化。通過對比同一冷藏時間、不同槲皮素添加量之間的TBARS值，發(fā)現除冷藏第1天時，0.05g/kg槲皮素組的TBARS值顯著高于其他處理組（P＜0.05）之外，其他同一冷藏時間、不同添加量之間均無顯著差異（P＞0.05），且此時槲皮素組的TBARS值與BHA組之間差異也不顯著（P＞0.05）。以上結果說明，槲皮素能有效降低肉糜在冷藏過程中的氧化程度，但添加量對抑制氧化效果的影響不大，且其作用效果與BHA相當。

　　在肌原纖維蛋白中，巰基含量較高且敏感性強，易被氧化成二硫鍵，導致蛋白質發(fā)生聚合和交聯，故巰基含量可作為判定蛋白氧化程度的指標之一。如圖2所示，各組巰基含量在冷藏過程中均逐漸降低，且冷藏第1～6天時，添加槲皮素和BHA均不能降低巰基損失的程度，說明此時二者不能有效抑制蛋白質氧化的發(fā)生。冷藏第9天時，0.05g/kg槲皮素組的巰基含量略高于空白組，但差異不顯著（P＞0.05），0.10g/kg和0.20g/kg槲皮素組以及BHA組的巰基含量均顯著高于空白組（P＜0.05），說明隨著貯藏時間的延長，較高添加量的槲皮素對蛋白質氧化有相對較好的抑制作用。肌原纖維蛋白中巰基含量降低是由于自由基攻擊蛋白分子導致其空間結構發(fā)生變化，促使內部包埋的巰基暴露，被氧化成二硫鍵。而槲皮素作為一種多酚物質，其分子結構中的3-OH基團與類黃酮結構中苯氧自由基通過電子共軛和錯位形成穩(wěn)定的平面立體結構，可以抑制自由基的產生，減少巰基的損失。Procházková等證實槲皮素的高抗氧化活性取決于其2,3-雙鍵和4-羰基結合Fe2+的螯合作用，該作用可阻礙槲皮素對蛋白質結構的攻擊。

　　2.3  槲皮素對肉糜蛋白質羰基含量的影響

　　蛋白質羰基含量可作為蛋白質氧化的一個重要指標，羰基的形成是一個復雜的過程，主要是由活性氧導致肽鏈的斷裂及活性氧攻擊氨基酸分子的氨基或亞氨基產生，經反應最終生成NH3和相應的羰基衍生物。羰基含量越高，蛋白質氧化損傷的程度越高。由圖3可知，隨貯藏時間的延長，羰基含量不斷增加，貯藏第1～9天，空白組羰基含量由3.56nmol/mg上升到4.34 nmol/mg（P＜0.05），說明氧化促使蛋白側鏈羰基化進程不斷加深。在貯藏1～6d時，除0.20g/kg槲皮素組的羰基含量顯著低于空白組外（P＜0.05），其他槲皮素組均與空白組差異不顯著（P＞0.05），說明槲皮素在較高添加量時能夠有效抑制蛋白質氧化，其抑制效果歸因于B環(huán)上3’,4’-OH基團對自由基的清除作用，含量越高則清除作用越強，這與Utrera等的研究結果一致。此外，槲皮素結構中的5個酚羥基基團和4-羰基結構，能夠有效清除自由基，與金屬離子螯合也可以阻止蛋白羰基化過程，減少羰基化合物的生成，抑制蛋白質氧化。

　　2.4  槲皮素對肉糜蛋白質表面疏水性的影響

　　疏水相互作用對蛋白質的結構和功能特性具有重大意義。疏水相互作用是一種非共價鍵相互作用，表面疏水性影響大分子間的相互作用，所以常用表面疏水性反映蛋白質構象的變化。一般用溴酚藍的結合量來表示表面疏水性的大小，蛋白質疏水性氨基酸殘基結合的溴酚藍的量越大，表面疏水性就越高，則可說明內部疏水基團暴露的就越多，蛋白質構象發(fā)生的變化就越大。由圖4可知，隨貯藏時間延長，肌原纖維蛋白的表面疏水性呈上升狀態(tài)，這是由于蛋白質被氧化導致構象發(fā)生變化，促使內部疏水性基團暴露，表面疏水性不斷升高。貯藏第1天時，除0.20g/kg槲皮素組外，其他組的表面疏水性均顯著高于空白組（P＜0.05），這可能是由于少量槲皮素與蛋白相互作用，打開部分蛋白構象，促進了疏水性基團的暴露，從而導致了表面疏水性增加。而在貯藏第3～9天時，除第6天添加量為0.05g/kg時的表面疏水性略高于空白組，其他各槲皮素組的表面疏水性均低于空白組，尤其是在第9天時，0.10、0.20g/kg槲皮素組的表面疏水性顯著低于空白組（P＜0.05），這是由于槲皮素可與蛋白質疏水區(qū)域發(fā)生非共價結合，降低了溴酚藍與疏水基團結合的幾率，表面疏水性降低；槲皮素還可通過與蛋白質發(fā)生共價交聯，形成巰基-醌或氨基-醌加成物，導致蛋白質形成相互纏結的大分子聚集體，將疏水基團掩蔽于其中；此外，蛋白質分子之間也可能發(fā)生疏水相互作用形成聚集物，掩蓋原本的疏水位點，使表面疏水性降低。

　　注：同一指標同列肩標小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；同行肩標大寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。表2同。

　　肉及肉制品的顏色是消費者對肉品質量評估的主要依據，其顏色主要取決于肌肉中色素物質肌紅蛋白和血紅蛋白的含量和變化狀態(tài)。由表1可知，貯藏第1天時，0.10、0.20g/kg槲皮素和BHA組的豬肉糜亮度（L*值）顯著高于空白組（P＜0.05），說明較高添加量的槲皮素對豬肉糜的亮度有提高作用。貯藏時間延長至第9天時，空白組的L*值高于槲皮素和BHA組，其可能的原因是槲皮素和BHA的添加有利于肉糜內部水分的保持，從而降低水分表面滲出率，減弱光的反射程度，使L*值下降。

　　貯藏過程中，空白組肉糜的紅度（a*值）顯著下降（P＜0.05），這是由于豬肉糜中的肌紅蛋白和血紅蛋白氧化程度不斷加重，逐漸變?yōu)榧t褐色，促使肉糜顏色變暗。貯藏過程中，槲皮素和BHA組肉糜的a*值均高于空白組，其中效果最顯著的是0.10g/kg槲皮素組，這可能是由于槲皮素特有的酚羥基結構與肌紅蛋白競爭脂質過氧化基團，抑制肌紅蛋白氧化，從而穩(wěn)定豬肉糜的顏色。而槲皮素添加量為0.2g/kg時a*值降低，這主要是槲皮素本身顏色的影響所致。

　　2.6  槲皮素對肉糜蒸煮損失率的影響

　　蒸煮損失率能夠表征肌肉的保水性，主要反映生肉到熟肉的加熱過程中肉樣水分的流失情況，蒸煮損失率越大，則說明肉樣的保水性越差。由圖5可知，隨貯藏時間的延長，各組肉糜的蒸煮損失率也不斷升高，其中空白組蒸煮損失由25.02%顯著上升至貯藏末期的34.35%（P＜0.05）。這與余小領等的研究結果一致，可能的原因是隨貯藏時間的延長，肉中蛋白質不斷溶出，分子不斷變小，使蛋白系水能力下降，從而導致蒸煮損失增加；此外，蛋白質氧化破壞蛋白質結構中C＝O和N—H基團與水分子之間的結合能力，氧化后凝膠網絡孔隙增多，使蛋白質的水合作用有所降低，也會導致蒸煮損失增加。在貯藏1、3d時，所有處理組肉糜的蒸煮損失與空白組相比差異均不顯著（P＞0.05），說明貯藏初期，槲皮素與肉糜中蛋白質的相互作用對其保水性的影響不明顯；貯藏第6、9天時，0.05g/kg和0.10g/kg槲皮素組肉糜的蒸煮損失率顯著低于空白組（P＜0.05），這可能是由于槲皮素與蛋白質發(fā)生共價交聯，起到“橋接”連接蛋白質的作用，利于蛋白質凝膠網絡結構的形成，從而增加了肉糜的系水能力；此外，適量槲皮素的加入能夠促進蛋白質功能基團的充分暴露，有利于熱凝膠形成過程中蛋白質分子之間的相互作用，也會提高肉糜的保水性。在整個貯藏過程中，0.20g/kg槲皮素組肉糜的蒸煮損失率略低于空白組，但差異一直不顯著（P＞0.05），說明槲皮素添加量過高反而不利于肉糜凝膠保水性的提高，這可能是由于過量的酚類物質覆蓋在蛋白質表面或與蛋白質分子的過度結合，從而削弱了蛋白質分子之間的相互作用，不利于凝膠網絡結構的形成。

　　2.7  槲皮素對肉糜質構特性的影響

　　食品的質構特性是影響消費者接受某種食品的重要因素之一。如表2所示，肉糜的質構特性分別由硬度、彈性、咀嚼度和回復性等指標反映。在貯藏過程中，空白組的硬度顯著下降（P＜0.05），這可能是因為氧化改變了蛋白結構，使其形成凝膠能力變差，從而使肉糜的硬度下降。而槲皮素和BHA組的硬度、彈性、咀嚼度和回復性隨貯藏時間的延長，整體呈顯著上升趨勢（P＜0.05），說明槲皮素與BHA能通過抑制蛋白的氧化來阻止蛋白變性，從而有利于蛋白網絡結構的形成，改善肉糜的質構特性。貯藏第1天時，槲皮素組的硬度和咀嚼度均低于空白組；隨著貯藏時間的延長，槲皮素組的硬度、彈性和咀嚼度逐漸高于空白組，說明槲皮素與蛋白的充分結合增強了蛋白凝膠結構的強度，且槲皮素的多酚結構能夠淬滅自由基，防止蛋白氧化產生的變性和裂解，使肉糜結構更穩(wěn)定。

　　隨冷藏時間的延長，空白組肉糜的脂肪和蛋白質氧化程度不斷加深，TBARS值不斷增加，總巰基損失量、羰基含量和表面疏水性不斷增大，致使肉糜顏色變暗，蒸煮損失增大，肉糜硬度和彈性下降；而添加槲皮素后，能顯著減少TBARS的生成，降低脂肪氧化程度；高添加量的槲皮素對降低巰基損失、增加表面疏水性以及減少羰基化合物生成的效果較好；低添加量的槲皮素能有效保持肉糜色澤，降低肉糜的蒸煮損失；槲皮素能增加肉糜硬度和彈性等。因此，以槲皮素作為抗氧化劑時，應選擇合適的添加量，使其不僅可起到抑制肉品氧化的作用，還可以改善肉品品質特性。