摘要：為研究超臨界CO2處理對(duì)鮮牛肉滅菌效果及食用品質(zhì)的影響，本實(shí)驗(yàn)考察了壓強(qiáng)、溫度和時(shí)間等因素對(duì)鮮牛肉滅菌效果影響，采用正交法優(yōu)化滅菌條件，并比較滅菌處理前后鮮牛肉食用品質(zhì)指標(biāo)。結(jié)果表明，在滅菌溫度50℃、滅菌壓強(qiáng)14MPa、滅菌時(shí)間10min時(shí)鮮牛肉滅菌效果最優(yōu)，滅菌率可達(dá)99%。此時(shí)鮮牛肉pH、肌纖維蛋白含量和硬度等指標(biāo)輕微下降但差異不顯著，肌漿蛋白含量顯著下降（P＜0.05）肉色變化顯著，紅度值a*較處理前低，而黃度值b*和量度值 L*均較處理前高（P＜0.05）蒸煮損失和剪切力均較處理前顯著降低（P＜0.05）。因此，超臨界CO2處理對(duì)鮮牛肉滅菌效果顯著，有利于提高牛肉的食用品質(zhì)。

　　關(guān)鍵詞：超臨界 CO2，鮮牛肉，滅菌，品質(zhì)，正交實(shí)驗(yàn)

　　超臨界CO2（SC--CO2）溫度＞31.1℃、壓強(qiáng)＞7.38MPa)是一種非水相溶劑，無(wú)毒無(wú)味、可循環(huán)利用，能夠溶解細(xì)胞膜中各組成成分。超臨界CO2能夠殺死食品中許多微生物并使部分酶失活，且能較好地保持食品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。陳宇等認(rèn)為，超臨界CO2殺菌機(jī)理在于卸壓時(shí)CO2急速膨脹導(dǎo)致細(xì)胞破裂，而Garcia等則認(rèn)為CO2引起微生物新陳代謝紊亂才是主要原因。

　　目前，國(guó)外開(kāi)展超臨界殺菌技術(shù)已有多年研究，超臨界CO2裝置和應(yīng)用研究在一些發(fā)達(dá)國(guó)家如美國(guó)、日本、意大利等均有報(bào)道。Sirisee等研究發(fā)現(xiàn)，絞細(xì)牛肉經(jīng)超臨界CO2( 31.03 MPa，42.5℃) 處理后，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌落下降了一個(gè)對(duì)數(shù)期。研究發(fā)現(xiàn)，絞細(xì)牛肉經(jīng)超臨界CO2處理后顏色發(fā)暗，這可能是高濃度CO2與肌紅蛋白作用而形成高鐵肌紅蛋白，以致使肉色變暗，尤其是在少量氧氣存在的情況下，這種情況更易發(fā)生。Hong等研究發(fā)現(xiàn)，壓力范圍50～200MPa，處理時(shí)間0～60min，肉的亮度值和紅度值明顯增加。日本研究人員發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)高壓處理牛肉肉質(zhì)鮮嫩，且富有彈性。還有實(shí)驗(yàn)表明，高壓能導(dǎo)致肌內(nèi)周膜與肌外周膜剝離及肌原纖維間隙增大，促進(jìn)了肌肉嫩化。在國(guó)內(nèi)，也有學(xué)者在不斷探索超臨界CO2滅菌模型及研究進(jìn)展。近年來(lái)，許多研究者也報(bào)道了在固態(tài)食品方面的超臨界CO2滅菌。在肉制品方面，孫源源研究了超臨界CO2對(duì)肉餡中細(xì)菌的殺菌效果并應(yīng)用兩種模型進(jìn)行了分析，但關(guān)于超臨界CO2對(duì)鮮牛肉滅菌效果及蛋白營(yíng)養(yǎng)和質(zhì)構(gòu)特性影響的研究報(bào)道很少。

　　本實(shí)驗(yàn)以鮮牛肉為研究對(duì)象，對(duì)牛肉中的嗜中溫需氧細(xì)菌、乳酸菌、嗜冷細(xì)菌的滅菌效果進(jìn)行了研究。研究不同殺菌溫度、壓強(qiáng)、時(shí)間下殺菌效果，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)滅菌條件進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定滅菌處理前后牛肉pH、肉色、剪切力、蛋白含量、蒸煮損失和質(zhì)構(gòu)特性等理化指標(biāo)，旨在研究超臨界CO2殺菌技術(shù)對(duì)鮮牛肉品質(zhì)的影響。

　　1  材料與方法

　　鮮牛肉外脊3500g購(gòu)買于甘肅張掖市萬(wàn)禾草畜產(chǎn)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，取1500g于4℃冷藏，剩下2000g牛肉切成25cm×25cm×80cm肉丁，置于4℃冷藏；牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基;K2HPO4、KH2PO4、磷酸緩沖液、所用培養(yǎng)基及溶液所需試劑均為分析純。

　　HA221－05－01超臨界萃取設(shè)備；CP214型電子天平；SYQ－DSX－280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器；SW－CJ－1FD型超凈工作臺(tái)；LHS－150SC 恒溫恒濕培養(yǎng)箱；便攜式pH型Ttesto205；CR－10色差計(jì)；UV756CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；TA.XTExpress 質(zhì)構(gòu)儀；BSA224S電子天平。

　　1.2  實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1  超臨界CO2殺菌過(guò)程  將超臨界設(shè)備處理釜預(yù)熱到設(shè)定溫度40℃，然后將處理好肉塊置于處理釜中( 釜提前經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%酒精消毒) 預(yù)熱。首先打開(kāi)進(jìn)氣閥和放氣閥，確?？諝馀懦?，然后關(guān)閉放氣閥，經(jīng)過(guò)5～10min的升壓過(guò)程達(dá)到設(shè)定壓力20MPa，然后樣品在設(shè)定條件進(jìn)行處理，樣品處理結(jié)束后，關(guān)閉進(jìn)氣閥，打開(kāi)放氣閥，經(jīng)過(guò)約15～20min卸壓，將處理釜取出移入超凈工作臺(tái)。

　　1.2.2  菌懸液制備  用無(wú)菌剪刀取檢樣深層肌肉25g，放入滅菌研缽內(nèi)剪碎、研磨后加入225mL磷酸鹽緩沖液混勻稀釋。取1mL稀釋液加入10mL磷酸鹽緩沖液，即1:100稀釋液。

　　1.2.3 微生物培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)  將滅菌后的和滅菌前牛肉按上述方法制備的菌懸液，每個(gè)濃度取0.1mL涂平板，每個(gè)濃度涂?jī)蓚€(gè)平板，然后在表1中培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，取30～300個(gè)菌落的培養(yǎng)皿，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)嗜中溫需氧細(xì)菌、乳酸菌、嗜冷細(xì)菌。

　　表1  微生物的培養(yǎng)條件

　　菌落總數(shù)參照GB 4789.2－2010《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》 進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果以對(duì)數(shù)表示。

　　1.2.4  實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

　　1.2.4.1  單因素實(shí)驗(yàn)  設(shè)定滅菌溫度45℃、滅菌時(shí)間15min，滅菌壓強(qiáng)分別8、10、12、14、16MPa；設(shè)定滅菌溫度45℃、滅菌壓強(qiáng)12MPa，滅菌時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min；設(shè)定滅菌時(shí)間15min、滅菌壓強(qiáng)12MPa，滅菌溫度為35、40、45、50、55℃；然后對(duì)牛肉進(jìn)行滅菌。同時(shí)做空白對(duì)照組，按上述方法檢測(cè)菌落總數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次平均值。

　　1.2.4.2  正交實(shí)驗(yàn)  根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定因素和水平，選取滅菌壓強(qiáng)、滅菌溫度和滅菌時(shí)間為因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平。采用 L9( 33) 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表2。

　　表2  L9( 33) 超臨界 CO2滅菌處理鮮牛肉正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平表

　　1.2.5  測(cè)定指標(biāo)

　　1.2.5.1   pH 測(cè)定  用干凈濾紙吸干肉樣表面殘留水分，用Testo205型便攜式pH計(jì)隨機(jī)對(duì)肉樣三個(gè)不同部位的新鮮切口進(jìn)行pH測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。

　　1.2.5.2  肉色測(cè)定  從肉樣上垂直于肌纖維方向切取0.5cm厚的切片，用CＲ－10型色差儀測(cè)定樣品肉色，讀取亮度( L*)、紅色度( a*) 和黃色度( b*)，每個(gè)肉樣測(cè)定3次，結(jié)果以平均值表示。

　　1.2.5.3  剪切力測(cè)定  取形狀規(guī)則(3cm×3cm×2cm) 的肉樣，水浴至中心溫度75℃后取出肉塊，冷卻至室溫，順著肌纖維方向用直徑1.27cm的取樣器鉆取3個(gè)肉柱，用壓力儀測(cè)定每個(gè)肉柱的剪切力值，求其平均數(shù)。

　　1.2.5.4  蒸煮損失測(cè)定  按照蔡淑偉相應(yīng)的測(cè)定方法進(jìn)行，取肉樣剔除筋膜稱質(zhì)量m1，然后放入蒸煮袋并密封，恒溫水浴，待肉樣中心溫度達(dá)70℃并保持20min，取出冷卻至室溫，稱質(zhì)量m2，按式計(jì)算蒸煮損失率。

　　蒸煮損失率(%)=(m1－m2)/m1×100

　　式中: m2指蒸煮后的肉樣質(zhì)量，g；m1指蒸煮前的肉樣質(zhì)量，g。

　　1.2.5.5  蛋白質(zhì)含量測(cè)定  參照J(rèn)oe等的方法測(cè)定蛋白質(zhì)溶解性。肌漿蛋白質(zhì)溶解度: 1g 肉樣加10mL冰冷的0.025mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)，冰浴條件下10000r/min勻漿20s，勻漿3次，4℃搖動(dòng)抽提12h。1500r/min 離心20min，上清液用雙縮脲法測(cè)定蛋白含量?？偟鞍踪|(zhì)溶解性: 1g肉樣加20mL冰冷的1.1mol/L碘化鉀在0.1mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)，冰浴條件下10000r/min勻漿20s3次，4℃搖動(dòng)抽提12h。1500r/min 離心20min，上清用雙縮脲法測(cè)定。肌纖維蛋白質(zhì)溶解性(mg/g)=總蛋白質(zhì)溶解性(mg/g)－肌漿蛋白質(zhì)溶解性(mg /g) 。

　　1.2.5.6  質(zhì)構(gòu)特性分析(TPA)  參考Stejskal V等的方法并稍作修改。樣品在恒溫水浴鍋中加熱至中心溫度達(dá)70℃并維持30min后自然冷卻至室溫，沿肌纖維方向?qū)悠沸拚麨楦叨?cm、橫截面 1cm×1cm試樣3份，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值表示。

　　測(cè)試條件: 采用“二次壓縮(TPA)”模式，探頭型號(hào)：P/50；下行速度:4 mm/s；測(cè)試速度: 6mm/s；返回速度: 6mm/s；下行距離：60%樣品厚度；兩次壓縮間隔時(shí)間：5s；觸發(fā)力：5g。本研究中選取硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性4個(gè)參數(shù)作為分析指標(biāo)。

　　1.2.6  數(shù)據(jù)處理  采用Microsoft Office Excel 2007 及IBM SPSS Statistics 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

　　2  結(jié)果與討論

　　2.1.1  處理壓強(qiáng)對(duì)鮮牛肉滅菌效果影響 一般來(lái)說(shuō)，壓強(qiáng)越高，殺菌效果越好，因?yàn)檩^高壓強(qiáng)能提高CO2滲透性，也能增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的物理性傷害。由圖1可以看出，隨著壓強(qiáng)增大，鮮牛肉中細(xì)菌殺滅對(duì)數(shù)值Y=－logS逐漸增大，即殘活率逐漸減小。當(dāng)壓強(qiáng)達(dá)到12MPa以上時(shí)，鮮牛肉中細(xì)菌Y值達(dá)到2.58，且增長(zhǎng)緩慢，表明滅菌壓強(qiáng)在大于12MPa可以有效地殺滅鮮牛肉中細(xì)菌。

　　2.1.2  處理時(shí)間對(duì)鮮牛肉滅菌效果影響  由圖2可以看出，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，Y值增長(zhǎng)緩慢，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到15min上時(shí)，鮮牛肉中細(xì)菌Y值達(dá)到2.55，接近峰值，可初步確定鮮牛肉處理時(shí)間為15min左右。

　　2.1.3  處理溫度對(duì)鮮牛肉滅菌效果影響  一般來(lái)說(shuō)，其他條件相同時(shí)，溫度越高殺菌效果越好，高溫可能增加CO2的擴(kuò)散性，能增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高殺菌率。由圖3可見(jiàn)，溫度較低時(shí)，殺滅對(duì)數(shù)值較小但增速較快，在50℃達(dá)到最大；繼續(xù)升高溫度，殺滅對(duì)數(shù)值的變化趨于緩和。

　　在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以殺滅對(duì)數(shù)值Y =－logS為指標(biāo)，對(duì)鮮牛肉中嗜中溫細(xì)菌( Y1 )、乳酸菌( Y2)、嗜冷菌(Y3) 的滅菌效果進(jìn)行分析，進(jìn)一步確定最優(yōu)滅菌組合。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

　　由表4極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)嗜中溫細(xì)菌滅菌效果影響程度為C＞B＞A，即壓強(qiáng)＞溫度＞時(shí)間；各因素對(duì)乳酸菌滅菌效果影響程度為 C＞B＞A，即壓強(qiáng)＞溫度＞時(shí)間；各因素對(duì)嗜冷菌滅菌效果影響程度為B＞C＞A，溫度＞壓強(qiáng)＞時(shí)間。由此可知，壓強(qiáng)和溫度是影響滅菌效果的主要因素，初步確定滅菌條件 A1B3C3，但考慮到實(shí)際操作成本和肉品質(zhì)影響，因此對(duì)各因素進(jìn)行顯著性方差分析見(jiàn)表5，來(lái)進(jìn)一步確定最優(yōu)滅菌條件。

　　注: 顯著水平:ns=不顯著，* p＜0.05，**p＜0.01，表6～表8同。

　　由表5可看出，因素 A、B、C對(duì)嗜中溫細(xì)菌滅菌效果均不顯著；但對(duì)于乳酸菌，因素C對(duì)其滅菌效果顯著；而對(duì)嗜冷細(xì)菌，因素B和C對(duì)其滅菌效果均顯著。由此可知，溫度和壓強(qiáng)是影響滅菌效果的主要因素，為節(jié)約成本，在滅菌時(shí)間對(duì)結(jié)果影響不顯著時(shí),降低時(shí)間也可達(dá)到相同滅菌目的。因此，本實(shí)驗(yàn)最終確定出鮮牛肉最優(yōu)滅菌條件為A1B3C3：溫度為50℃、壓強(qiáng)為14MPa、時(shí)間為10min。

　　2.3  驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

　　在最優(yōu)滅菌條件: 溫度50℃、壓強(qiáng)14MPa、時(shí)間10min下，對(duì)鮮牛肉進(jìn)行滅菌處理，總細(xì)菌殺滅對(duì)數(shù)值達(dá)到最大為3.42個(gè)數(shù)量級(jí)，即滅菌率可達(dá)99%，此驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，該條件下對(duì)細(xì)菌滅菌效果較好。

　　2.4  超臨界CO2滅菌技術(shù)對(duì)鮮牛肉品質(zhì)影響研究

　　表6結(jié)果顯示，鮮牛肉pH滅菌處理后差異不顯著，但有降低趨勢(shì)，可能是由于鮮牛肉在超臨界CO2處理過(guò)程中，CO2在高壓條件下與牛肉中的水分反應(yīng)，產(chǎn)生了少量 H2CO3，導(dǎo)致鮮牛肉pH在超臨界處理后略微降低，但這不影響鮮牛肉整體品質(zhì)。鮮牛肉紅度值a*在滅菌處理前后差異顯著，處理后鮮牛肉紅度值a*明顯低于處理前，這可能是由于肌漿中肌紅蛋白和血紅蛋白在壓力作用下逐漸變性而失去所固有紅色，導(dǎo)致肌肉中紅色逐漸變淡、發(fā)灰色，最后呈類似煮肉灰白色的緣故。鮮牛肉黃度值b*和亮度值L*均在滅菌處理前后差異極顯著，滅菌前黃度值b*明顯小于滅菌后，而處理之亮度值L*顯著增加，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Choi等的研究結(jié)果一致。產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能是由于肌紅蛋白中球蛋白變性或者亞鐵血紅素被取代或失去所造成的的緣故，但有關(guān)理論還需進(jìn)一步研究。鮮牛肉的嫩度值在滅菌處理后差異極顯著，其嫩度值顯著升高。這是由于高壓處理對(duì)肌肉具有一定嫩化作用。高壓處理后肉質(zhì)變嫩表明在加壓處理過(guò)程中肌肉的肌節(jié)結(jié)構(gòu)受損，肌纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。鮮牛肉蒸煮損失在滅菌處理后差異顯著，處理后的鮮牛肉蒸煮損失明顯低于處理前，這是由于鮮牛肉在超臨界CO2處理過(guò)程中水分流出而導(dǎo)致的緣故。

　　注: 最優(yōu)滅菌條件: 溫度50℃、壓強(qiáng)14MPa、時(shí)間10min下進(jìn)行; 表7、表8同。

　　表7分析結(jié)果顯示，鮮牛肉的肌纖維蛋白含量在滅菌處理前后差異不顯著，但是肌漿蛋白含量和總蛋白含量變化顯著，均有不同程度的降低?？赡苁怯捎诟邏涸斐杉{蛋白變性使其可溶性降低或是高壓導(dǎo)致肌原纖維蛋白質(zhì)凝聚降低了肌質(zhì)蛋白的吸光率。

　　表8表明，鮮牛肉的硬度在滅菌處理后差異不顯著，有降低趨勢(shì)，滅菌處理后的鮮牛肉彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性差異不顯著但有升高趨勢(shì)。另外，鮮牛肉的粘性值在滅菌處理前后基本不變，這說(shuō)明超臨界CO2滅菌處理不影響鮮牛肉的質(zhì)構(gòu)特性。

　　3  結(jié)論

　　影響超臨界CO2對(duì)鮮牛肉滅菌效果的主要因素是壓強(qiáng)和溫度。當(dāng)滅菌溫度為50℃、滅菌壓強(qiáng)為14MPa、處理時(shí)間為10min時(shí)滅菌效果最優(yōu)，滅菌率達(dá)99%；鮮牛肉在超臨界CO2處理前后的質(zhì)構(gòu)變化不顯著，肌纖維蛋白含量無(wú)顯著變化，肌漿蛋白含量顯著下降，從而影響肉色( 黃度值和亮度值)變化；超臨界CO2滅菌技術(shù)處理后的鮮牛肉pH無(wú)顯著變化，嫩度顯著提高，而蒸煮損失顯著下降，一定程度上改善牛肉食用品質(zhì)。