摘要：隨著生命科學(xué)與生物技術(shù)的快速發(fā)展，國際上農(nóng)畜產(chǎn)品安全檢測技術(shù)正在向著檢測方法與技術(shù)的通量化、快速化、自動化和智能化等方向發(fā)展。而免疫檢測方法由于其具有特異性和靈敏性、其試劑具有穩(wěn)定性、操作具有簡便性，因此適合推廣應(yīng)用。其中蛋白芯片法與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）方法比較，具有高通量，樣品用量少，一份樣品可同時進行多指標(biāo)分析，大大降低了檢測的成本，提高了檢測的效率，并且檢測限與靈敏度等均與ELISA方法相當(dāng)。動物源性食品種類和成分較為復(fù)雜，目標(biāo)化合物的檢測限較低，各目標(biāo)化合物的性質(zhì)差異大，且可能同時存在多種組分。因此，近年來蛋白芯片在食品安全檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用也日漸增多。本文就蛋白芯片技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用進行綜述，以期為食品安全現(xiàn)場快速檢測提供參考。

　　關(guān)鍵詞：蛋白芯片；食品安全檢測；綜述
 

　　1 引言

　　20世紀(jì)80年代末以來，由于一系列食品原料的化學(xué)污染、畜牧業(yè)中抗生素的應(yīng)用、基因工程技術(shù)的應(yīng)用，使食品污染導(dǎo)致的食源性疾病呈上升趨勢，食品安全問題為全世界所關(guān)注?，F(xiàn)場的食品快速檢測方法要求實驗準(zhǔn)備簡化，使用的試劑較少，配制好的試劑保存期長；樣品前處理簡單，對操作人員要求低；分析方法簡單、準(zhǔn)確和快速?；瘜W(xué)比色法、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和免疫膠體金試紙法是目前應(yīng)用比較成熟的現(xiàn)場快速檢測方法。隨著食品安全相關(guān)檢測裝備的進步，食品安全檢測車的出現(xiàn)，一些新的現(xiàn)場快速檢測技術(shù)得以應(yīng)用，如蛋白芯片技術(shù)的加入為現(xiàn)場檢測提供了更廣闊的發(fā)展空間。本文就蛋白芯片技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用進行綜述，以期為食品安全現(xiàn)場快速檢測提供參考。
 

　　2 蛋白芯片概述

　　蛋白芯片技術(shù)是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新方法，它是在基因芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。蛋白芯片技術(shù)主要采用微陣列點樣等方法將大量生物大分子如抗原或抗體等樣品有序地固定在玻片、膜、硅膠片、多孔板等支持物的表面，組成密集的二維分子陣列，然后與標(biāo)記的待測生物樣品中的靶分子實現(xiàn)特異性反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果用化學(xué)發(fā)光法、熒光法、酶催化底物顯色法、同位素法等方法顯示，最后通過特定的儀器對信號的強度進行快速、并行、高效地檢測分析，并進行數(shù)字化處理提供定性和定量分析結(jié)果，判斷樣品中靶分子的含量，從而達到分析檢測的目的。
 

　　蛋白芯片技術(shù)不僅適用于大分子化合物（如蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)菌）的檢測，也適用于小分子化合物（如抗生素、激素等）的測定。蛋白芯片法與傳統(tǒng)ELISA方法比較，具有高通量，樣品用量少，一份樣品可同時進行多指標(biāo)分析等優(yōu)勢，大大降低了檢測的成本，提高了檢測的效率，并且檢測限與靈敏度等均與ELISA方法相當(dāng)。動物源性食品種類和成分較為復(fù)雜，目標(biāo)化合物的檢測限較低，各目標(biāo)化合物的性質(zhì)差異大，且可能同時存在多種組分。因此，近年來蛋白芯片在食品安全檢測等領(lǐng)域的應(yīng)用也日漸增多。
 

　　3 蛋白芯片在食品安全檢測中的應(yīng)用
 

　　蛋白芯片分析方法在食品中的農(nóng)獸藥殘留、生物毒素殘留、食源性致病微生物及轉(zhuǎn)基因食品的檢測等方面具有巨大的應(yīng)用潛力，具有使用樣品體積少，不需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理，并且高通量和快速等特點。
 

　　3.1 在農(nóng)獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

　　在食品安全檢測中，農(nóng)獸藥殘留檢測是非常重要的一個環(huán)節(jié)。在實際生產(chǎn)過程中，快速篩選方法比實驗室中確證的定量分析更具有實際意義，而蛋白芯片具有高通量、快速的檢測特點正適用于大規(guī)模生產(chǎn)中的快速篩選。Knecht等在硅烷化修飾的片基上制備10種抗生素抗原點陣，包括β-內(nèi)酰胺類、磺胺類及氨基糖苷類等，通過化學(xué)發(fā)光法檢測牛奶中抗生素殘留含量。整個檢測過程只需5min，且實現(xiàn)了自動化。Kloth等建立的蛋白芯片間接競爭化學(xué)發(fā)光免疫法，能在幾分鐘內(nèi)同時定量檢測牛奶中磺胺類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類等13種抗生素含量。該方法靈敏度較高，但化學(xué)發(fā)光的檢測設(shè)備較昂貴，很難在基層推廣應(yīng)用。劉楠等建立了一種高通量懸浮蛋白芯片檢測方法，將方法首先應(yīng)用于氯霉素和克倫特羅兩種獸藥殘留的同時高通量檢測，此后應(yīng)用于氯霉素、克倫特羅、雌二醇、泰樂菌素4種獸藥和阿特拉津、吡蟲啉、甲萘威3種農(nóng)藥的同時檢測，整個檢測過程只需1～2h，可滿足多種農(nóng)獸藥殘留檢測的靈敏、特異、快速和高效的需求。左鵬等報道了一種基于載玻片的熒光免疫微陣列蛋白芯片法，用于同時檢測食品中氯霉素和磺胺二甲嘧啶2種抗生素殘留，以及牛奶中磺胺二甲嘧啶、鏈霉素和泰樂菌素3種抗生素的含量，該方法簡單、快速、靈敏度高、可滿足大量樣本快速初篩，檢測限均低于國家規(guī)定的最大允許殘留量。Liu等用熒光免疫微陣列蛋白質(zhì)芯片法同時測定鰻魚中孔雀石綠、己烯雌酚、甲羥孕酮和3-氨基-2-惡唑烷酮的含量。并將該蛋白質(zhì)微陣列方法與用于這四種分析物的市售試劑盒進行比較，兩種方法的結(jié)果一致。Raz等描述了基于表面等離子體共振的免疫傳感器建立了牛奶中氨基糖苷類（新霉素、慶大霉素、卡那霉素和鏈霉素），磺胺類（磺胺二甲嘧啶），氯霉素類（氯霉素）和氟喹諾酮類（恩諾沙星）殘留物的無標(biāo)記多重檢測系統(tǒng)。多重殘留的檢測可用于測量μg/L水平的所有目標(biāo)化合物，其對于歐盟確定的最大允許殘留水平的牛奶控制足夠敏感。本實驗室基于可視化微孔板芯片開發(fā)了多種檢測方法，實現(xiàn)了同時檢測牛奶中慶大霉素，牛奶中磺胺類和喹諾酮類，牛奶中諾氟沙星和惡喹酸，牛奶中黃曲霉毒素，頭孢氨芐，三聚氰胺，以及蜂蜜中四環(huán)素，蜂蜜中4種硝基呋喃代謝物的同時檢測，檢測靈敏度高，可滿足高通量快速檢測需求。此外，基于智能手機可視化微孔板芯片同時檢測牛奶中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素殘留檢測，實現(xiàn)單孔定量檢測。目前蛋白芯片法檢測各種殘留物為食品生產(chǎn)企業(yè)對產(chǎn)品出廠的把關(guān)，以及相關(guān)部門對食品質(zhì)量安全的快速抽查提供了技術(shù)支持。
 

　　3.2 在生物毒素殘留檢測中的應(yīng)用

　　在過去的幾十年里，農(nóng)業(yè)食品系統(tǒng)中的霉菌毒素污染一直是全球的一個嚴(yán)重問題。真菌毒素是真菌在農(nóng)產(chǎn)品和飼料中生長時產(chǎn)生的有毒次生代謝產(chǎn)物。近年來開發(fā)了多種霉菌毒素的檢測技術(shù)，基于免疫的蛋白芯片檢測方法由于其靈敏度高和檢測時間短而得到了廣泛應(yīng)用。Wang等開發(fā)了一種免疫芯片，可在4h內(nèi)同時定量檢測水中黃曲霉毒素B1，黃曲霉毒素M1，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，豬曲霉毒素A，T-2毒素和玉米赤霉烯酮6種霉菌毒素的濃度，具有使用樣品量少和肉眼可視半定量的優(yōu)點。Hu等研究了一種基于無污染聚合物刷的熒光競爭免疫測定微陣列用于黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），赭曲霉毒素A（ochratoxinA，OTA）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）多種真菌毒素的靈敏檢測，檢測限分別為4，4和3pg/mL，并且與常規(guī)ELISA方法相當(dāng)或甚至更好。Li等基于表面增強拉曼散射（surface enhanced Ramanscattering，SERS）的免疫傳感器被開發(fā)用于檢測食品中的3種真菌毒素（AFB1、ZEA、OTA）。測定的檢測限AFB1為0.061～0.066μg/kg，ZEA為0.53-0.57μg/kg，OTA為0.26-0.29μg/kg。Wang等使用3D等離子體納米柱陣列的表面增強拉曼散射對多種霉菌毒素（OTA、伏馬菌素B（Fumonisin B，F(xiàn)UMB）和AFB1）進行免疫分析。對于OTA、FUMB和AFB1，檢出限（limit of detection，LOD）被確定為5.09、5.11、6.07pg/mL。Pagkali等（321介紹了一種無標(biāo)記的光學(xué)生物傳感器，用于快速同時測定啤酒樣品中的黃曲霉毒素B1（AFB1），伏馬菌素B1（fumonisinsB1，F(xiàn)B1）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）3種霉菌毒素。AFB1、FB1、DON的檢測限分別為0.8、5.6、24ng/mL，而檢測時間僅為12min。表面等離子體共振成像（surface plasmon resonanceimaging，SPRi）是無標(biāo)記，實時和高通量免疫測定的強大工具，但其靈敏度需要必要的改進。Wei等到報道了單層石墨烯涂層金芯片可以有效地增強表面等離子體共振（surface plasma resonance，SPR）的靈敏度。以抗玉米赤霉烯酮（ZEN）為研究對象，結(jié)果表明檢測信號可以增強40%。Schulz等基于電化學(xué)生物芯片用于快速和便攜式自動化現(xiàn)場檢測蛤蚌毒素，T-2毒素以及黃曲霉毒素M1及其相應(yīng)的同源物等低分子量毒素，能夠在17min內(nèi)檢測到ng/mL水平。Beloglazova等使用基于量子點（quantum dot，QDs）的免疫化學(xué)技術(shù)開發(fā)了多重?zé)晒饷庖呶綔y定（fluorescence immunosorbent assay，F(xiàn)LISA）方法。使用基于直接競爭性免疫測定法同時檢測ZEA和AFB1，檢出限為1.8和1μg/kg。
 

　　3.3 在食源性致病微生物檢測中的應(yīng)用

　　食源性致病微生物是食源性流行病的原因，因此需要迅速檢測食品中的病原體。在瓊脂平板上接種進行預(yù)富集培養(yǎng)是標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，qPCR的分子檢測方法實現(xiàn)了24h內(nèi)檢測病原體。此外，生物傳感器可以在富集培養(yǎng)早期實現(xiàn)快速檢測。Magliulo等已經(jīng)開發(fā)了一種簡單快速的多重夾心化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法，用于同時檢測大腸桿菌0157：H7（Escherichia coli O157：H7）、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。為了實現(xiàn)4種病原體的多重檢測，設(shè)計了一種新的聚苯乙烯96孔微量滴定板形式，其中每個主要孔在底部包含4個子孔。對每種細(xì)菌特異的單克隆抗體分別固定在每個子孔中。當(dāng)將樣品加入主孔中時，能夠特異性結(jié)合相應(yīng)單克隆抗體的細(xì)菌被捕獲在4個子孔中的一個。隨后，加入針對4種細(xì)菌的過氧化物酶標(biāo)記的多克隆抗體混合物，并使用基于魯米諾的化學(xué)發(fā)光法進行檢測。該測定簡單快速，所有細(xì)菌種類的定量限為104～105CFU/mL。通過將結(jié)果與常規(guī)培養(yǎng)方法進行比較來評估該方法的準(zhǔn)確性，結(jié)果令人滿意，回收率為90%～120%。該方法可用作篩選試驗，以評估這些病原菌在不同食品中的含量。熊亮斌等在硝酸纖維素膜上制備的可視化蛋白芯片，可檢測西瓜中果斑病菌，具有較好的特異性和重復(fù)性。與酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）相比，可視化蛋白芯片的檢測靈敏度和陽性檢出率均相當(dāng)，但檢測時間更短，僅為ELISA法的八分之一，所需檢測樣本量更少，結(jié)果肉眼可視等優(yōu)點。胡娟等也在硝酸纖維素膜上制備的可視化蛋白芯片，用于黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測，以50批葫蘆科種子為樣品，對可視化蛋白芯片檢測與ELISA檢測結(jié)果進行了比較，其檢測結(jié)果吻合率達98.0%，經(jīng)PCR檢驗，檢測結(jié)果一致性良好。說明該方法能對植物病毒做出快速、準(zhǔn)確的檢測。Palmiro等剛開發(fā)并測試了一種蛋白質(zhì)芯片，用于篩選和鑒定5種常見病原體，包括沙門氏菌，大腸桿菌（E. coli），金黃色葡萄球菌，彎曲桿菌和李斯特菌，該蛋白質(zhì)芯片在病原體鑒定中具有高度特異性，可以快速，可靠地篩選出污染食品中這5種常見病原體。
 

　　3.4 在轉(zhuǎn)基因食品檢測中的應(yīng)用

　　隨著全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究人員利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出了抗除草劑、抗重金屬、抗病蟲害、抗干旱、耐鹽堿和營養(yǎng)價值高的品種，這對于提高產(chǎn)量、減少損失以及增加農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)價值具有重要作用。然而轉(zhuǎn)基因作物在帶來巨大社會和經(jīng)濟效益的同時也存在許多問題，主要集中在轉(zhuǎn)基因食品的安全性及對生態(tài)環(huán)境的安全性方面。因此世界各國都在加強對轉(zhuǎn)基因食品的管理。蛋白芯片法可以檢測出轉(zhuǎn)基因食品中外源基因表達出來的蛋白質(zhì)，汪琳等研制了一種蛋白芯片可同時檢測3種轉(zhuǎn)基因成分表達的BTCry1Ac蛋白、植酸酶蛋白、BTCrylAh蛋白。將3種蛋白質(zhì)所對應(yīng)的單克隆抗體點于環(huán)氧基修飾的片基上，其檢測靈敏度分別為：BTCry1Ac蛋白35ng/mL、植酸酶蛋白20ng/mL、BTCry1Ah蛋白30ng/mL，具有較高的靈敏度、特異性和可靠性。
 

　　3.5 在動物疫病檢測中的應(yīng)用

　　病毒感染是全世界畜禽養(yǎng)殖場發(fā)病率的主要原因。血清學(xué)檢測技術(shù)包括血細(xì)胞凝集抑制（hemagglutination inhibition，HI）、瓊脂凝膠沉淀素（AGAR gel precipitin，AGP）測試、免疫熒光測定（immunofluorescence assay，IFA）和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）等。雖然這些方法的價值和重要性是顯而易見的，但它們不能同時進行檢測。蛋白芯片法可同時檢測多個血清樣品中的抗體。石霖等利用可視化蛋白芯片法對禽流感、新城疫2種禽病血清抗體和禽流感、新城疫、雞傳染性支氣管炎和傳染性法氏囊病4種禽病血清抗體同時檢測。該芯片具有快速、簡便、靈敏、特異性的特點，無需特殊儀器，成本低。血清樣品檢測可信度高，且靈敏度高于瓊脂擴散實驗，可推廣到基層使用。Wang等開發(fā)了一種可視化蛋白芯片可以同時檢測禽流感病毒，新城疫病毒，傳染性支氣管炎病毒和傳染性法氏囊病病毒誘導(dǎo)的抗體。與傳統(tǒng)方法相比，該蛋白芯片顯示出良好的靈敏度，是瓊脂凝膠沉淀法的400倍以上，且相互之間無交叉反應(yīng)。Sheng等制備的瓊脂糖凝膠蛋白芯片，實現(xiàn)了對魚淋巴囊腫病毒的檢測。通過優(yōu)化瓊脂糖凝膠基片表面的化學(xué)結(jié)構(gòu)和檢測抗體的標(biāo)記物等，實現(xiàn)魚淋巴囊腫病毒的最低檢測限為0.0686μg/mL，與酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）的一致率為100%，免疫熒光測定技術(shù)的一致率為98%。趙玉輝等建立一種檢測A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）抗體的蛋白芯片，利用蛋白芯片分別對15個亞型流感病毒免疫血清、SPF雞血清、抗新城疫病毒血清、抗法氏囊病毒血清和現(xiàn)地血清樣品進行檢測，通過與血凝抑制試驗比較，表明建立的蛋白芯片方法具有良好的靈敏性和特異性，為AIV抗體檢測及制備檢測AIV不同亞型或多種病原抗體的蛋白芯片提供方法。顧大勇等將禽流感病毒H1、H3、H5、H7、H9、N1、N2、NP、NS1等9種亞型抗原以最佳濃度，點樣于玻璃載體表面，構(gòu)建相應(yīng)抗體的檢測芯片，分別用于禽類不同類型禽流感病毒血清及隨機選擇的人血清檢測，并對特異性、敏感性及重復(fù)性進行測試，與血凝抑制法進行雙向驗證比較，結(jié)果一致。劉志玲等建立了牛地方流行性白血病的液相蛋白芯片檢測方法，檢測結(jié)果與ELISA試劑盒檢測結(jié)果的符合率為94.6%，為牛地方流行性白血病的進出境檢疫、疫病監(jiān)測和流行學(xué)調(diào)查研究提供了一種特異、敏感的新型快速檢測技術(shù)。曾夢等建立了豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體的熒光微球免疫學(xué)檢測方法，紀(jì)方曉等建立了豬戊型肝炎病毒液相蛋白芯片檢測方法，方法與商品化ELISA試劑盒檢測結(jié)果一致，為建立豬病多重檢測方法提供了基礎(chǔ)。
 

　　4 總結(jié)與展望

　　已報道的蛋白芯片方法相比于傳統(tǒng)的檢測方法如色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)雖有多靶標(biāo)、快速、高靈敏度等優(yōu)點，但是存在諸如檢測儀器復(fù)雜、價格昂貴、操作繁瑣、通量低等問題，不適合在基層檢測機構(gòu)和小的食品生產(chǎn)企業(yè)推廣應(yīng)用。本課題組建立的基于可視化蛋白芯片的檢測方法，可同時檢測多種藥物及有害物殘留引和同時檢測多種營養(yǎng)蛋白質(zhì)的含量。與傳統(tǒng)生物芯片相比，具有可視化，可直接用肉眼觀察芯片結(jié)果，無需使用昂貴的熒光或化學(xué)發(fā)光檢測設(shè)備?？梢暬镄酒瑪[脫了昂貴的生物芯片分析儀器，大大降低了檢測成本，提高了可操作性、應(yīng)用性和推廣性。