在以前的文章中，我們已經(jīng)詳細(xì)介紹了蛋白降酶的脂類(lèi)氧化在傳統(tǒng)火腿成熟過(guò)程所起的作用。相比之下很少有人關(guān)注微生物活動(dòng)對(duì)火腿成熟的意義，但是這并不能表明微生物對(duì)火腿風(fēng)味形成不起作用，比如金華火腿成熟后期通常會(huì)有黑、白及綠色的霉菌附著在表面上。1．傳統(tǒng)火腿成熟過(guò)程中的菌相分析1．1．微生物的數(shù)量變化陳士怡等人(1983)研究表明金華火腿精肉層的微生物總量是脂層量13倍(1315×10３菌落數(shù)/cm２\Vs\98×10５菌落數(shù)/cm２)，但是不同月份的脂層和精肉層的總微生物是隨取樣月份的推遲呈現(xiàn)減少趨勢(shì)，并且脂層中的總微生物量下降速度高于精肉層。
Lars.Hinrichsenetal.(1995)對(duì)29個(gè)分別代表6個(gè)不同加工階段的意大利玻馬火腿進(jìn)行的菌相分析結(jié)果如表所示：總體上看肉表面比皮表面微生物多。在BHI瓊脂平板計(jì)數(shù)和DEFT分析間的差異是由于微生物物理及生化狀態(tài)的不同，在DEFT分析程序中死細(xì)胞也被包括在內(nèi)，而這些細(xì)胞不能在BHI培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因此隨著加工的進(jìn)行在BHI上的菌落數(shù)少于DEFT上的菌落數(shù)。另外，即使在火腿加工的最后階段，火腿肌肉內(nèi)部仍有8．5×10２微生物存在，而這個(gè)數(shù)量級(jí)的微生物用DEFT法是檢測(cè)不到的。
表1　處于不同加工階段，不同部位火腿肉的微生物菌落數(shù)的變化 CFU /g加工時(shí)間/d　　　0　　　25　　　　125 　　　　200　　　　375　　　　485肉面BHI ager　4×107．2×108．4×108．2×108．3×108 ．1×10．8肉面DEFT　　1×107．8×106．1×108．5×107．3×108 ．1×10．8皮面BHI ager　1×108．5×107．1×107．3×105．8×103 ．7×10．3皮面DEFT　　3×107．6×106．1×107．5×105．6×105 ．1×10．5深層肉組織BHI ager8×103．1×103．9×102．8×102．9× 102．85×10．2BHI ager-brain heart infusion．DEFT-direct epitfluorescent filter technique( 直接表面熒光過(guò)濾技術(shù))CFU，conolyforming units1．2．菌相分析陳士怡等人(1983)對(duì)常規(guī)生產(chǎn)金華火腿微生物進(jìn)行了定量定性分析，并對(duì)幾種優(yōu)勢(shì)菌進(jìn)行了 生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)特性試驗(yàn)。最終從火腿表層微生物分離鑒定獲得霉菌491株，酵母菌86株，細(xì)菌1 20株。霉菌中有226株是青霉，159株是曲霉，青霉中產(chǎn)黃青霉、圓弧青霉和蠟葉芽枝霉占優(yōu)圖1．發(fā)酵階段金華火腿表層微生物菌相變化圖 勢(shì)；酵母菌分屬于裂殖酵母屬、陰球酵母屬等；細(xì)菌中芽孢桿菌32株、微球菌屬22株，還有 葡萄球菌屬、假單孢桿菌屬以及黃桿菌屬等，針對(duì)不同加工階段的菌相變化見(jiàn)圖1。這些微 生物均屬于中溫型微生物，具有分解蛋白質(zhì)和脂肪的能力，對(duì)腐敗菌具有一定的拮抗效應(yīng)， 可以認(rèn)為某些微生物和火腿質(zhì)量存在一定的關(guān)系。
Lars.Hinrichsen et al(1995)對(duì)意大利傳統(tǒng)火腿的細(xì)菌和酵母分析情況如以下3圖所示：3 d以后，肉表面覆蓋著49%的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，這些桿菌中一般有過(guò)氧化氫酶及氧化酶活性； 29%腸細(xì)菌(Enterobacteriaceae)；5%微球菌(Micrococaceae);5%棒狀桿菌(Corynebacteriu mspp);4%酵母(Yeasts);12%未知微生物，圖2．肉表面菌落變化圖3．肉皮表面菌落變化圖4．肌肉內(nèi)部細(xì)菌分布 這些微生物逐漸占據(jù)主要地位，在125d后它們占據(jù)了總菌量95%。即使在211d后仍占98%。在 365d后，成熟產(chǎn)品中：75%革蘭氏球菌(無(wú)過(guò)氧化氫酶及氧化酶活性)；17%微球菌；8%的未知 菌種，酵母及乳酸菌占8%。經(jīng)過(guò)額外的120d的后熟階段(總加工時(shí)間達(dá)485d)。
微生物的分布情況仍未改變。Molina etal.(1989a.b.)在干腌及陳化處理的火腿中發(fā)現(xiàn)了未 被確切分類(lèi)的革蘭氏陽(yáng)性菌，在西班牙Serrano火腿中測(cè)得26%不定型的鏈狀桿菌(Atypic sr eptobacteria)。
在最初加工階段中肉皮表面，革蘭氏陰性桿菌處于主導(dǎo)地位：微球菌25%；棒狀桿菌占7%； 腸桿菌占55%；未知菌種占22%。而且微球菌隨后逐漸占據(jù)主導(dǎo)地位，并在125d后含量近似為 100%，在365d后的成熟產(chǎn)品中微球菌仍占63%，酵母為6%，未知菌種28%。經(jīng)歷120d的后熟期 后(總加工期達(dá)到485d，)，在肉皮表面的微生物菌落數(shù)完全改變，此時(shí)腸細(xì)菌占55%，革蘭 氏陽(yáng)性球菌占41%，微球菌占4%。
另外Carrascosa et al.Lars于1992年試驗(yàn)表明在火腿后熟階段中無(wú)腸球菌存活，而1Hinric hsen et al.(1995)卻吃驚地發(fā)現(xiàn)了它的存活。根據(jù)Baldinl and Raczynski(1979)研究。腸 細(xì)菌在產(chǎn)品最初低溫、逐漸脫水、含鹽量逐漸上升的幾星期內(nèi)檢測(cè)不到。因此Lars Hinrich sen et al.(1995)的試驗(yàn)結(jié)果可以解釋為：取樣前產(chǎn)品被污染了。另外也可能是細(xì)菌分析鑒 定錯(cuò)誤。DEFT計(jì)數(shù)表示肉皮表面的微生物數(shù)量下降。這可能導(dǎo)致菌落的某些性質(zhì)無(wú)法測(cè)定， 從而導(dǎo)致錯(cuò)誤的分類(lèi)。
火腿肌肉內(nèi)部的微生物在加工第3d后，革蘭氏陰性棒桿菌占總菌落數(shù)的55%；未知菌種24%； 微球菌占14%。在25d后，微球菌占83%并在211d后仍占主導(dǎo)地位。在365d后變?yōu)椋?5%的革蘭 氏陽(yáng)性球菌，22%的微球菌。經(jīng)過(guò)120d的后熟期后(總加工時(shí)間達(dá)到485d)，微球菌(Micrococ caceae)又占據(jù)主導(dǎo)地位；占總菌落數(shù)的93%。而且從1971年到1993年期間，微球菌不斷被很 多研究者分別在玻馬火腿和西班牙火腿中測(cè)得。另外，Lars.Hinrichsen etal.(1995)研究 顯 示：在整個(gè)加工過(guò)程中火腿內(nèi)部微生物菌落數(shù)量是隨革蘭氏陽(yáng)性菌的交替分布而變化的，所 以產(chǎn)品中微生物的作用是極其復(fù)雜的，可能是總菌落中每一個(gè)菌落都對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味有所貢獻(xiàn)。 腐敗火腿中微生物分析與485d后的火腿完全一致。還有微生物分析顯示：在切片火腿深層肌 肉柔軟部位有腐敗產(chǎn)生，但結(jié)果并不明顯。對(duì)它進(jìn)行特殊的細(xì)菌分離發(fā)現(xiàn)了革蘭氏陰性菌。
總之，火腿常規(guī)生產(chǎn)從鮮腿進(jìn)入腌制期，由于腿中含水量大，鹽分較高，溫度8～10℃， 分離到的微生物以數(shù)量不多的細(xì)菌為主，特別是適應(yīng)性較強(qiáng)的芽孢桿菌和嗜鹽性微球菌屬較 多。此后火腿經(jīng)洗曬風(fēng)干后進(jìn)入發(fā)酵前期，此時(shí)火腿水分變化不大，溫度略為上升(15～2 0℃)，金華火腿面出現(xiàn)青霉、芽枝霉；發(fā)酵中后期火腿含水量下降，溫度上升到25～30℃此 時(shí)霉菌生長(zhǎng)處于優(yōu)勢(shì)地位，特別是曲霉數(shù)量急劇上升。
2．微生物與火腿風(fēng)味的相關(guān)性傳統(tǒng)火腿傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程中鹽腿上有大量微生物生長(zhǎng)，其中有對(duì)火腿質(zhì)量有害的菌群，也有對(duì) 火腿風(fēng)味形成有益的菌群，針對(duì)這種觀點(diǎn)很多研究者做了大量研究工作。
2．1．微生物對(duì)火腿風(fēng)味的有害影響2．1．1．霉菌很多研究者已經(jīng)對(duì)不同的完全成熟火腿上的真菌做過(guò)詳細(xì)研究，分離到的菌株絕大部分為青 霉菌屬(Penicillium)和曲霉菌(Aspergillus)屬。其中以Nunez et.al.,(1996)的研究具有 代表性，他主要考察了伊比麗亞火腿成熟過(guò)程的真菌菌落變化情況和自然成熟上霉菌的產(chǎn)毒 情況：與微球菌和酵母在伊比麗亞火腿中的變化情況，霉菌在成熟過(guò)程中數(shù)量增加， 腌制以后僅分離到P.commmune屬。只有當(dāng)火腿表面Aw達(dá)到0．88～0．79時(shí)，曲霉屬和散囊菌 屬開(kāi)始占據(jù)主導(dǎo)地位，因此可以通過(guò)控制火腿最終Aw值來(lái)減少曲霉屬可能造成的危害。另外 ，在成品中處于優(yōu)勢(shì)地位的散囊菌屬在整個(gè)加工過(guò)程中均有存活。有很多研究者考察了青霉 屬、曲霉屬和散囊菌屬在低水分活度或低相對(duì)濕度的成熟過(guò)程中的演變：曲霉僅在成熟初期 仍有存活，然而散囊菌屬在伊比麗亞火腿整個(gè)成熟過(guò)程及成品中均有存活。隨著時(shí)間的推移 ，散囊菌屬/曲霉屬比值逐漸增加。毒性試驗(yàn)表明產(chǎn)毒霉菌發(fā)病率和毒性水平同其它肉制品 中所分離到的真菌相當(dāng)。
總之，在傳統(tǒng)火腿整個(gè)成熟過(guò)程中均有真菌存活，其中包括產(chǎn)毒素霉菌，因此霉菌對(duì)火腿加 工具有雙重作用：一是它可以對(duì)火腿風(fēng)味和外觀產(chǎn)生有益作用；二是霉菌也分泌毒素。所以 在加工過(guò)程中應(yīng)當(dāng)采取措施抑制有害霉菌地生長(zhǎng)，但是這些措施通常也會(huì)抑制有益菌地生長(zhǎng) ，采用不產(chǎn)毒素的菌株作為發(fā)酵劑可以解決這一問(wèn)題。
2．1．2．腸細(xì)菌在Serrano火腿微球菌是普遍存在的菌落，葡萄球菌處于主導(dǎo)地位，通常我們把腸細(xì)菌科作 為衛(wèi)生指標(biāo)菌，M.E.Marin et.,al.(1996)考察了腸細(xì)菌在傳統(tǒng)火腿的演變，以評(píng)價(jià)加工過(guò) 程及產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況。腸細(xì)菌在低溫、逐漸脫水及鹽濃度增加的腌制過(guò)程中至少下降了兩個(gè) 數(shù)量級(jí)，需氧嗜溫菌在腌制過(guò)程中有所上升，腌制過(guò)后腸細(xì)菌菌落數(shù)下降到10cfu/g以 下，成品中嗜溫菌菌落數(shù)為104cfu/g。不恰當(dāng)?shù)碾缰品椒〞?huì)使火腿滋生腐敗腸細(xì)菌，最終導(dǎo)致火腿在腌制結(jié)束前發(fā)生腐敗。
2．2．微生物對(duì)火腿風(fēng)味的有益影響金華火腿傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程中火腿上有大量微生物生長(zhǎng)，其中有對(duì)火腿質(zhì)量有害的菌群，也有對(duì) 火腿質(zhì)量有益的菌群，所以在火腿成熟過(guò)程中進(jìn)行抑菌試驗(yàn)對(duì)于考察微生物活動(dòng)與火腿質(zhì)量 間的關(guān)系是很有意義的。陳士怡(1980)在金華火腿微生物的人工接種及縮短生產(chǎn)周期的初步 試驗(yàn)表明：以分離到的青霉4號(hào)接種和以1%苯甲酸抑菌的兩組質(zhì)量較好；縮短火腿生產(chǎn)周期 的模擬試驗(yàn)有一定成效，由原來(lái)的8～10個(gè)月縮短到4個(gè)月；經(jīng)火腿的感官評(píng)定和游離氨基酸 分析表明，質(zhì)量與常規(guī)生產(chǎn)的相比無(wú)顯著差異。這可能是由于青霉4號(hào)對(duì)有害微生物有抑制 作用，從而保證了火腿質(zhì)量，與抑菌組的作用相似。他的試驗(yàn)不足在于：各個(gè)處理組的樣品 數(shù)量太少(青霉4號(hào)接種最多有10個(gè)，75%酒精抑制菌最少只有3個(gè)重復(fù))不足以充分說(shuō)明問(wèn)題 。
Lars.Hinrichsen et al.于1995年取了29個(gè)分別代表6個(gè)不同加工階段的玻馬火腿做為樣品 考察微生物與火腿風(fēng)味形成間的關(guān)系。大量的揮發(fā)性物質(zhì)，化學(xué)變化，感觀評(píng)定表數(shù)據(jù)以及 分離到的微生物數(shù)量顯示火腿風(fēng)味形成分為兩個(gè)階須：第一階段包括，腌制、干制及成熟初 期，主要發(fā)生自動(dòng)氧化；第二階段包括，火腿成熟及后熟過(guò)程，主要是微生物的次級(jí)代謝特 別 是氨基酸代謝過(guò)程。主要是在它的次級(jí)代謝風(fēng)味物質(zhì)形成，如帶甲基分支的醛、次級(jí)醇、甲 基酮、乙基酯、二甲基三硫化合物。
為了明確微生物對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味的影響，我們還要弄清產(chǎn)品中都發(fā)生了哪些與微生物有關(guān)的化學(xué) 反應(yīng)。傳統(tǒng)火腿加工中最顯著的變化是：產(chǎn)品水分下降，鹽分上升；相比之下，硝酸鹽、亞 硝酸鹽、pH值的變化很少。但也有例外，如Huerta et al.(1988)在西班牙干腌火腿中就觀 察到了硝酸鹽及亞硝酸鹽濃度上升。在玻馬火腿沒(méi)有這種現(xiàn)象是由于肉中硝酸還原細(xì)菌作用 的結(jié)果，并且很多人在其它干腌火腿也發(fā)出了同樣結(jié)果。腐敗火腿比完全成熟火腿的pH值略 有上升，這應(yīng)是火腿中蛋白過(guò)度水解造成的。
相關(guān)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成過(guò)程：甲基分支的醛可以由微生物生成，如代謝L—亮氨酸生成3— 甲基正丁醛、L—異亮氨酸生成2—甲基正丁醛和L—Val生成2—甲基丙醛。Ventanas et al( 1992)推測(cè)在由二酮存在及低水分活度情況下甲基酮也可以通過(guò)Stecker degradation 途徑 生成。然而B(niǎo)elitz and Grosch(1986)的研究提出，這些反應(yīng)通常在高溫或高流體靜水壓條 件下發(fā)生。而這與火腿加工條件是不相符的。眾所周知，羰基化合物和次級(jí)醇可經(jīng)以下途徑生成：先是游離脂肪酸β—氧化，再經(jīng)硫代水解酶水解生成β—酮酸(不同微生物會(huì)生成 不同的酮酸)。Gottschalk(1985)指出β—酮酸也可脫羧基生成甲基酮，或進(jìn)一步還原生成 相應(yīng)的次級(jí)醇。乙基酯由乙醇和羧基酸的酶促反應(yīng)生成。微生物代謝可以生成乙基酯。Gott schalk(12985)明確提出：正是微生物導(dǎo)致發(fā)酵香腸中生成乙基酯。他認(rèn)為揮發(fā)物中的二甲 基三硫化合物是由微生物的肽及氨基酸代謝生成的。
從以上分析，我們可以認(rèn)為：微生物對(duì)玻馬火腿的風(fēng)味形成起重要作用。因?yàn)閹缀跛信c火 腿風(fēng)味有關(guān)的物質(zhì)都可由微生物的次級(jí)代謝生成(特別是氨基酸代謝)。在試驗(yàn)中已被觀察到 的硝酸鹽還原活性證明火腿中的微生物確實(shí)有活躍的代謝作用。另外，自動(dòng)氧化似乎并不重 要，因?yàn)樗a(chǎn)生的物質(zhì)對(duì)火腿風(fēng)味貢獻(xiàn)不大。但是在玻馬火腿風(fēng)味形成中微生物所起的確 切作用還是不清楚。Lars 1.Hinrichsen et al在處于不同加工階段的玻馬火腿中分別檢測(cè) 出幾種不同的微生物菌落，其中大部分是微球菌。然而，我們卻無(wú)法判斷出，究竟是哪一種 微生物起主要作用，到底是微生物生成的酶重要還是肌肉內(nèi)在固有酶重要。