摘要：為了提高畜禽骨的粉碎率，以促進畜禽骨的回收利用效率，本文以豬骨為原料，比較了高壓處理和酶解次序?qū)ωi骨粉碎率的影響，并對豬骨高壓處理后的酶解工藝采用響應(yīng)面法優(yōu)化和對所得骨粉的鈣、磷營養(yǎng)物質(zhì)含量進行了測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬骨經(jīng)高壓處理后再酶解所得粉碎率較高壓處理前酶解所得粉碎率高；響應(yīng)面法優(yōu)化豬骨高壓處理后的酶解工藝，得出酶解溫度為55℃、酶解時間為2.01 h、pH 為7.00、加酶量為10363 U/g 時所得豬骨的粉碎率最高（82.0%），比未優(yōu)化前提高了9.45%；對粉碎前后豬骨中鈣磷營養(yǎng)物質(zhì)含量分析，得出高壓和酶解輔助機械粉碎對豬骨中鈣磷損失小?？傊?，高壓處理后酶解輔助機械破碎法有效提高了豬骨的粉碎率，所得骨粉的鈣磷營養(yǎng)物質(zhì)與原始豬骨中的鈣磷含量相似。
關(guān)鍵詞：骨素；酶解；木瓜蛋白酶；畜禽骨
畜禽骨是畜禽加工最主要的副產(chǎn)物。2013年我國的肉類總產(chǎn)量8373萬t，位居世界第一。以畜禽骨約占胴體重10%~30%計算，2013年產(chǎn)生的鮮骨約837~2512萬t 左右。畜禽骨的營養(yǎng)豐富，如果不對這些骨副產(chǎn)物有效利用，不僅造成資源的極大浪費，而且還會因為骨頭富含營養(yǎng)物質(zhì)易腐敗變質(zhì)而污染環(huán)境。因此，回收利用畜禽骨對畜禽加工業(yè)高效、可持續(xù)發(fā)展非常重要。目前，國內(nèi)外研究人員開展了很多利用畜禽骨的途徑，如將畜禽骨磨粉制作飼料，提取骨膠原蛋白等，但是均因為畜禽骨硬度較高、難粉碎而導(dǎo)致利用率低。
畜禽骨中含有大量的骨膠原蛋白是導(dǎo)致其難粉碎的主要原因。如果利用化學(xué)水解法使骨頭軟化，不僅會降低骨頭的營養(yǎng)價值，而且還會造成鈣的嚴重流失。若直接食用，比如熬骨頭湯等，鈣溶出率太低。因此，在最大程度保留畜禽骨中營養(yǎng)物質(zhì)的同時將畜禽骨粉碎，對畜禽骨的回收利用非常急需。研究發(fā)現(xiàn)，酶解法可以使骨中的蛋白質(zhì)分解，如Michel Linder 等人酶
解小牛骨回收骨蛋白，Benjakul 利用中性和堿性蛋白酶水解牙鱈的廢棄物回收蛋白質(zhì)，趙妍嫣等人用胰酶和木瓜蛋白酶混合酶解豬板骨提高骨的鈣溶出率等。此外，研究發(fā)現(xiàn)高壓和熱處理可以使蛋白變性和分解，但將酶解和高壓處理結(jié)合以提高畜禽骨粉碎率的研究較少。牡蠣殼等貝類經(jīng)粉碎后過400目篩可獲得超微骨粉顆粒，此時超微骨粉的消化吸收率得到了很好改善。因此，本研究以豬骨為原料，利用酶解和高壓輔助機械破碎制備超微骨粉，以制備超微畜禽骨骨粉。
1 材料與方法
1.1 材料
新鮮豬脊骨和臀骨購于明蜀新村十陵菜市場。木瓜蛋白酶購于鄭州龍生化工產(chǎn)品有限公司，酶活50萬U/g。
1.2 實驗方法
1.2.1 超微骨粉制作流程
豬骨→去肉、破碎→高壓處理→酶解→膠體磨粉碎處理→分離→干燥→骨粉
1.2.2 豬骨的預(yù)處理
將新鮮的豬脊骨和臀骨去肉，手動剁成約1cm×1cm 的小方塊。
1.2.3 高壓處理
稱取100g 骨塊加入高壓鍋，以骨水比1:30 (m/m)混合，高壓處理90 min。高壓處理時間以高壓鍋開始沸騰時計算。
1.2.4 酶解處理
用木瓜蛋白酶對高壓處理后的骨水混合液進行酶解，加酶量、酶解溫度、酶解時間及酶解pH 值見表1。
1.2.5 膠體磨處理
用X-250兩級膠體磨對酶解豬骨進行超微粉碎。粉碎時將膠體磨上刻度調(diào)至6，下刻度調(diào)至5，循環(huán)磨碎3次。
1.2.6 分離及干燥
將經(jīng)過膠體磨處理的骨漿直接過分樣篩，分樣篩的目數(shù)依次為40目、60目、100目、120目、140目、160目、180目、200目、250目、300目、350目、400目，收集過400目篩的樣品，將收集物置于ZFA-D5140鼓風(fēng)干燥箱于80℃干燥至衡重。
1.2.7 粉碎率計算
以通過400目篩的骨粉重量占整個骨頭重量的百分率評價粉碎程度。粉碎率η的計算式如下：
Η= m400 /mtotal×100%
注：m400 指過400目篩的骨粉的質(zhì)量，單位為克（g）；mtotal骨頭總重，單位為克（g）。
1.2.8 豬骨中鈣、磷含量測定
豬骨中鈣含量測定按照GB/T 9695.13-2009 中滴定法測定，磷含量根據(jù)GB/T 9695.4-2009 中分光光度法測定。
1.2.9 響應(yīng)面設(shè)計
采用5中心、4因素、1相應(yīng)、21次試驗、Hartley法設(shè)計試驗方案，各因素編碼及水平見表1。
表1 響應(yīng)面因素編碼及水平
| 溫度 (TEM)/℃ | 時間 (TIM)/h | pH | 加酶量 (EN)/(U/g) | |
| -1.68179 | 40.00 | 2.00 | 4.00 | 5000.00 |
| -1 | 46.08 | 2.61 | 4.61 | 6418.89 |
| 0 | 55.00 | 3.5 | 5.50 | 8500.00 |
| 1 | 63.92 | 4.39 | 6.39 | 10581.11 |
| 1.68179 | 70.00 | 5.00 | 7.00 | 12000.00 |
1.3 數(shù)據(jù)處理與分析
用EXCEL2010和SAS9.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和響應(yīng)面實驗方案設(shè)計。
2 結(jié)果與討論
2.1 酶解和高壓處理次序?qū)Ψ鬯槁实挠绊?/div>
為了分析酶解和高壓處理次序?qū)Ψ鬯槁实挠绊懀瑢ωi骨進行高壓處理前和高壓處理后，在固定料液比為1:30（m/m），加酶量7500 U/g、酶解溫度55℃、酶解時間3h、pH 7.0時酶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高處理前加木瓜蛋白酶酶解制備的豬骨粉碎率為67.54%，高壓處理后加木瓜蛋白酶酶解制備的豬骨粉的粉碎率為72.52%。高壓處理后酶解使豬骨的粉碎率提高了6.86%。由此可知，高壓處理后酶解有利于提高豬骨粉碎率。
高壓處理使骨頭軟化，骨蛋白變得易于酶解。骨蛋白的酶解導(dǎo)致豬骨的天然結(jié)構(gòu)破壞，出現(xiàn)微小孔洞，這使得豬骨易于被膠體磨粉碎。這可能是高壓處理后酶解使豬骨的粉碎率提高的主要原因。
酶解過程受酶解溫度、酶解時間、加酶量及pH 影響較大。由于在分析酶解和高壓輔助處理次序?qū)ωi骨粉碎率影響時，是在固定的酶解條件下進行的。所以，有必要研究最優(yōu)的酶解工藝，以進一步提高骨粉的粉碎率。
2.2 酶解工藝優(yōu)化
2.2.1 實驗方案
根據(jù)文獻報道的木瓜蛋白酶酶解豬骨的工藝條件，本研究確酶解溫度40.00~70.00℃，酶解時2.00~5.00h，酶解pH4.00~7.00，加酶量5000~12000 U/g為豬骨酶解參數(shù)的取值范圍。由此獲得的響應(yīng)面實驗方案見表2。根據(jù)設(shè)定的實驗方案獲得的實驗結(jié)果見表3。
表2 響應(yīng)面實驗方案及實驗結(jié)果
| 組號 | 溫度（TEM）/℃ | 時間（TIM）/h | pH | 加酶量（EN）/（U/g） | Y1 |
| 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | 68.47 |
| 2 | 1 | -1 | -1 | 1 | 71.10 |
| 3 | -1 | 1 | -1 | -1 | 60.32 |
| 4 | 1 | 1 | -1 | -1 | 75.56 |
| 5 | -1 | -1 | 1 | -1 | 63.94 |
| 6 | 1 | -1 | 1 | -1 | 71.76 |
| 7 | -1 | 1 | 1 | 1 | 69.69 |
| 8 | 1 | 1 | 1 | 1 | 73.40 |
| 9 | -1.68179 | 0 | 0 | 0 | 53.51 |
| 10 | 1.68179 | 0 | 0 | 0 | 72.49 |
| 11 | 0 | -1.68179 | 0 | 0 | 74.61 |
| 12 | 0 | 1.68179 | 0 | 0 | 76.35 |
| 13 | 0 | 0 | -1.68179 | 0 | 74.50 |
| 14 | 0 | 0 | 1.68179 | 0 | 77.52 |
| 15 | 0 | 0 | 0 | -1.68179 | 68.20 |
| 16 | 0 | 0 | 0 | 1.68179 | 76.65 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 0 | 75.39 |
| 18 | 0 | 0 | 0 | 0 | 72.61 |
| 19 | 0 | 0 | 0 | 0 | 73.50 |
| 20 | 0 | 0 | 0 | 0 | 72.65 |
| 21 | 0 | 0 | 0 | 0 | 75.15 |
注：表中TEM 代表酶解溫度，℃；TIM 代表酶解時間，h；pH 代表酶解液pH；EN 代表加酶量，U/g；Y1 豬骨的粉碎率。
2.2.2 擬合分析
對表2 中的實驗結(jié)果進行擬合分析，所得擬合結(jié)果的顯著性分析見表3。表3中各因素的P值顯示，酶解溫度（P=0.000207＜0.05）和加酶量（P=0.028381＜0.05）對豬骨粉碎率的影響顯著； 酶解時間（ P=0.575944＞0.05）和pH（P=0.344393＞0.05）對豬骨的粉碎率無顯著影響。根據(jù)各因素的P值大小可知，各因素對豬骨粉碎率的影響強弱依次為酶解溫度＞加酶量＞pH＞酶解時間。
表3中主模型的P=0.003787＜0.05顯示，建立的模型具有顯著性，結(jié)合失擬項P=0.075957＞0.05、R2=0.96.23說明，所得模型能較好的反映粉碎率與酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量之間的關(guān)系。
表3 各因素及主模型的顯著性分析
| 分類 | 自由度 | 均方差 | F值 | P值 |
| TEM | 1 | 275.3345 | 63.57866 | 0.000207 |
| TEM | 1 | 1.513798 | 0.349558 | 0.575944 |
| pH | 1 | 4.560191 | 1.053013 | 0.344393 |
| EN | 1 | 35.70133 | 8.243946 | 0.028381 |
| TEM×TEM | 1 | 262.4548 | 60.60455 | 0.000237 |
| TEM×TEM | 1 | 9.03125 | 2.085444 | 0.198824 |
| TEM×pH | 1 | 5.02445 | 1.160217 | 0.322811 |
| TEM×EN | 1 | 34.9448 | 8.069252 | 0.029542 |
| TIM×TIM | 1 | 0.73379 | 0.169442 | 0.694908 |
| TIM×pH | 1 | 4.210364 | 0.972233 | 0.362201 |
| TIM×EN | 1 | 0.764595 | 0.176556 | 0.688982 |
| pH×pH | 1 | 2.499539 | 0.577179 | 0.4762 |
| pH×EN | 1 | 0.009953 | 0.002298 | 0.963319 |
| EN×EN | 1 | 11.01455 | 2.543415 | 0.161866 |
| 主模型 | 14 | 47.40037 | 10.94542 | 0.003787 |
| 一次項 | 4 | 82.64388 | 19.08365 | 0.001463 |
| 二次項 | 4 | 69.76106 | 16.10882 | 0.002315 |
| 交互項 | 6 | 8.997569 | 2.077667 | 0.197574 |
| 誤差 | 6 | 4.330612 | ||
| 失擬項 | 2 | 9.411237 | 5.256793 | 0.075957 |
| R2 | 0.96.23 | |||
注：表中TEM 代表酶解溫度，℃；TIM 代表酶解時間，h；pH 代表酶解液pH；EN 代表加酶量，U/g
Y1=-219.573+7.328689×TEM+1.289928×TIM+6.115669×pH+0.011851×EN-0.05267×TEM2+0.136131×TEM×TIM-0.099826×TEM×pH-0.000113×TEM×EN+0.289425×TIM2-1.447454×TIM×pH-0.000264×TIM×EN+0.516316×pH2-0.00003×pH×EN-1.982E-7×EN2（1）
注：式中TEM代表酶解溫度，℃；TIM代表酶解時間，h；pH代表酶解液pH；EN代表加酶量，U/g；Y1豬骨的粉碎率。
2.2.3 擬合模型驗證
為了進一步確定所得模型的可靠性，對酶解工藝進行隨機重復(fù)試驗，所得實際粉碎率（Y1）及根據(jù)模型計算的粉碎率（Y2）見表4。表4 中相對誤差結(jié)果顯示，模型的預(yù)測結(jié)果與實測結(jié)果的相對誤差均小于5%。由此可見，建立的數(shù)學(xué)模型很好的反映了酶解溫度、酶解時間、加酶量及pH與豬骨粉碎率之間的相互關(guān)系。因此，所得模型（1）可用于酶解工藝的優(yōu)化。
2.2.4 酶解工藝優(yōu)化
根據(jù)式（1）對木瓜蛋白酶酶解高壓處理后豬骨的工藝進行優(yōu)化，得到酶解溫度55℃，酶解時間2.01h，酶解pH7.00，加酶量10363 U/g 時，豬骨的粉碎率最高。在該工藝條件下，可以使豬骨的粉碎率達到82.0%。
表4 擬合模型在預(yù)測過400 目分樣篩骨粉百分率的有效性驗證
| 組號 | 溫度/℃ | 時間/h | pH | 加酶量/（U/g） | Y1 /% | Y2/% | 相對誤差/% |
| 1 | 50 | 2 | 4.5 | 7000 | 65.98 | 64.08 | -2.88075 |
| 2 | 55 | 3 | 6 | 8000 | 74.47 | 74.03 | -0.59594 |
| 3 | 60 | 3.5 | 6.44 | 10000 | 77.07 | 76.50 | -0.73691 |
| 4 | 55 | 5 | 7 | 8500 | 75.05 | 74.90 | -0.20553 |
| 5 | 55 | 3.5 | 5.5 | 8500 | 74.74 | 73.97 | -1.03425 |
注：表中Y1 為過400目分樣篩骨粉百分率的真實值；Y2為過400目分樣篩骨粉百分率的預(yù)測值。
酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量對豬骨粉碎率的影響也可以通過響應(yīng)面圖看出（圖1）。圖1顯示，豬骨的粉碎率（Y1）隨酶解溫度（TEM）的變化最明顯，其次為加酶量（EN）；豬骨的粉碎率（Y1）與酶解時間（TIM）和pH 的變化較酶解溫度和加酶量弱。這與酶解溫度、酶解時間、pH及加酶量對豬骨粉碎率影響顯著性分析結(jié)果一致。
圖1 酶解最優(yōu)工藝的響應(yīng)面
注：圖中TEM代表酶解溫度，℃；TIM 代表酶解時間，h；pH 代表酶解液pH；EN 代表加酶量，U/g；Y1 豬骨的粉碎率。
2.3 骨粉中鈣、磷含量比較
為了分析高壓和酶解輔助處理對豬骨中鈣、磷含量的影響，對新鮮豬骨及制備的豬骨粉中鈣、磷含量分別測定，得出新鮮豬骨的鈣含量為14.00%，高壓、酶解處理后制備的骨粉的鈣含量為13.60%，輔助處理對豬骨中鈣含量的損失率為2.86%。新鮮豬骨含磷量7.35%，高壓、酶解處理后制備的骨粉含磷量為7.10%，輔助處理對豬骨中損失率為3.40%。
比較新鮮豬骨和輔助處理后骨粉中鈣和磷的比值，分別為1.90 和1.91，鈣磷比約等于2。由鈣和磷的損失率分別為2.86%和3.40%，并結(jié)合鈣、磷比約等于2的結(jié)果可知，高壓、酶解輔助制備超微骨粉輔助處理能較好地保留新鮮骨粉的鈣磷含量。
3 結(jié)論
高壓處理豬骨后酶解較高壓處理前酶解所得骨粉的粉碎率高。對高壓處理后酶解工藝采用響應(yīng)面法優(yōu)化，得出酶解溫度為55℃，酶解時間為2.01h，酶解pH7.00，加酶量為10363 U/g 時所得豬骨的粉碎率最高為82.0%，比未優(yōu)化前提高了9.45%。對粉碎前后豬骨中的鈣磷含量分析，得出高壓和酶解輔助粉碎對豬骨中的鈣磷含量損失較小。因此，高壓和酶解輔助處理，可有效提高豬骨的粉碎率。
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