摘要：為了降低干腌火腿鈉含量，應(yīng)用40% KCl替代NaCl對火腿原料進行腌制，采用強化高溫成熟現(xiàn)代工藝制備干腌火腿，分析加工過程中火腿股二頭肌鹽分含量、水分含量、pH、蛋白水解指數(shù)、肽氮和氨態(tài)氮含量，研究KCl替代對火腿加工過程中組織蛋白酶B和L潛在酶活力變化的影響。結(jié)果表明：40% KCl替代NaCl對火腿中組織蛋白酶B和L潛在酶活力變化無顯著影響（p＞0.05），風干成熟產(chǎn)品理化指標、蛋白水解指數(shù)、肽氮和氨態(tài)氮含量等無顯著差異（p＞0.05）說明采用40% KCl替代NaCl對干腌火腿的蛋白質(zhì)降解過程無顯著影響（p＞0.05）。
關(guān)鍵詞：火腿，KCl替代，蛋白質(zhì)水解，組織蛋白酶。
以金華火腿為代表的中國傳統(tǒng)火腿因其色澤鮮亮，滋味豐富、風味美好而廣受國內(nèi)外消費者喜愛。但傳統(tǒng)火腿因其加工周期長（8~10個月），產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、鹽分含量高（8%~12%）的缺點限制了其消費規(guī)模。國內(nèi)章建浩等利用人工氣候調(diào)節(jié)系統(tǒng)成功地將干腌火腿的加工周期縮短到了80 d，獲得了質(zhì)量穩(wěn)定、感官品質(zhì)達到傳統(tǒng)火腿標準的現(xiàn)代工藝產(chǎn)品。
火腿因其獨特的加工特點及保藏需要，食鹽的使用量很高，然而，有醫(yī)學(xué)研究表明飲食高鈉與心血管疾病的發(fā)生呈正相關(guān)性。國內(nèi)外學(xué)者為降低肉制品中氯化鈉含量已開展較多研究，主要是通過降低加工肉制品中氯化鈉添加量和用其他鹽（KCl、MgCl2、CaCl2）部分替代氯化鈉來實現(xiàn)。Alino等用KCl、CaCl2和MgCl2部分代替NaCl，Guardia等用KCl與乳酸鉀混合物替代發(fā)酵香腸中50%的NaCl，發(fā)現(xiàn)可顯著降低產(chǎn)品鈉離子含量且產(chǎn)品品質(zhì)無顯著影響。吳海舟等以豬后腿肉為原料制作培根，添加20%~60%的KCI部分替代NaCl研究其對蛋白質(zhì)降解及產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響，得出最佳替代比例為40%。以上研究表明用KCI來部分替代NaCl降低干腌肉制品中鈉離子含量是一種最可行的方法。
由于NaCl與火腿中蛋白質(zhì)的降解變化緊密相關(guān)，因此KCl的使用可能會對蛋白質(zhì)的降解過程產(chǎn)生影響。目前，國內(nèi)對使用KCI來部分替代NaCl進行火腿腌制加工的研究尚待完善，KCl的使用對蛋白質(zhì)降解過程的影響還有待明確。本文采用40%的KCl替代NaCl對火腿進行腌制，采用強化高溫風干成熟新工藝來加工火腿，研究了食鹽替代對火腿加工過程中的蛋白質(zhì)降解規(guī)律的影響，為開發(fā)低鈉新工藝火腿提供理論依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
豬后腿（肥膘適中、重量在（15±0.5）kg，經(jīng)火腿師傅修割成型）；氯化鉀（食品級）；食鹽南京市售；Z-Arg-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC（≥98%）、AMC、EDTA、Triton X -100、；Briji 35 ；硝酸銀、硫氰酸鉀、磺基水楊酸、茚三酮、亮氨酸氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均。
IKA-ULTEA-TURRAXT18型Basic分散機；Beckman Allegra 64R型高速冷凍離心機；JA2203N型電子天平；UV-2600型紫外分光光度計；M2e型多功能酶標儀；96孔酶標板；2300型KjeltecTM自動凱氏定氮儀；101-O-S型電熱恒溫鼓風干燥箱；JYL-C020九陽料理機。
1.2 實驗方法
1.2.1 工藝流程及取樣方法 ?火腿制作工藝流程及參數(shù)參照章建浩的方法：原料腿選擇→修胚→攤涼→上鹽堆疊→腌制（4℃，60 d）→發(fā)酵成熟（10~15℃，75% RH，10 d；16~20℃，65% RH，15 d；21~30 ℃，55% RH，15 d；31~35℃，60% RH，15d；35~37℃，70% RH，45d）→貯藏后熟。實驗設(shè)計兩個處理組分別為KCl替代組：腌制用鹽量為6.5%，配比為60% NaCl+40% KCl；食鹽對照組：腌制用鹽量為6.5%，配比為100% NaCl。
取火腿工藝過程中原料（工藝點1）、腌制結(jié)束（工藝點2）、成熟30 d（工藝點3）、成熟60 d（工藝點4）、成熟100d（工藝點5）5個工藝點的股二頭肌中間樣品為實驗材料，每個工藝點各取3條腿，剔除脂肪及可見筋膜后切碎，真空包裝，于-40 ℃凍藏。
1.2.2 水分含量測定 ?按照GB/T 5009.3-2010《食品中水分的測定》中的直接干燥法測定水分含量。
1.2.3 鹽分含量測定 ?參照GB/T 9695.8-2008《肉與肉制品中氯化物含量測定》中的佛爾哈德法，鹽分含量以NaCl含量計。
1.2.4 pH測定 ?參照GB/T 9695.5-2008《肉與肉制品中pH測定》。
1.2.5 蛋白質(zhì)水解指數(shù)（P.I.%）測定 ?參照江慧等的方法。
1.2.6 氨態(tài)氮和肽氮提取根據(jù)Ketelaere等方法稍作修改，樣品解凍后剔除可見脂肪、結(jié)締組織并絞碎，準確稱取5.000 g與50 mL 0.6 mol/L HClO4混合，高速分散器勻漿三次（5000 r/min，20s）。勻漿液以5000 r/min離心10 min，上清液用中速定性濾紙過濾并收集濾液，濾渣與10 mL 0.6 mol/L HClO4混合后再以5000 r/min離心10 min，上清液用中速定性濾紙過濾并收集濾液，該濾液與前面所得濾液合并。然后用NaOH溶液調(diào)pH至6.0，4℃放置2h后用蒸餾水定容至100 mL。
1.2.7 氨態(tài)氮含量（AN）測定 ?采用Palacios等方法稍作修改，取1.2.6中的提取液10 mL與10 mL 10%磺基水楊酸混合，在0~1℃放置17 h。然后用NaOH溶液調(diào)pH至6，中速濾紙過濾后蒸餾水定容至50mL。取樣液1mL進行茚三酮比色反應(yīng)，利用亮氨酸繪制標準曲線。
1.2.8 肽氮含量（PeN）測定 ?參照Palacios等方法稍作修改，取1.2.6中的提取液3 mL加入到10 mL 6 mol/LHCl溶液，混勻后于120℃沙浴24 h，然后用NaOH溶液調(diào)pH至6，過濾后蒸餾水定容至50mL。取樣液1mL進行茚三酮比色反應(yīng)，標準曲線與氨基氮標準曲線一致。肽氮含量為此次得到氮含量與1.2.7中氨基氮含量之差。
1.2.9 組織蛋白酶B活力測定 ?參照趙改名的方法。
1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析
實驗重復(fù)數(shù)為3，所有實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel2010進行整理并用SAS 8.2統(tǒng)計軟件進行方差分析（analysis of variance，ANOVA），取標準差，平均值之間利用Fisher’s最小顯著差異法（the least significantdifference method，LSD）進行差異顯著性檢驗。
2 結(jié)果與討論
2.1 KCl替代NaCl對干腌火腿加工過程中理化指標的影響
由表1可知，鹽分含量隨著火腿加工過程的進行呈顯著上升的趨勢（p＜0.05），成熟結(jié)束處理組間鹽分含量無顯著差異（p＞0.05）。腌制結(jié)束時，火腿鹽分含量由0.11%迅速增至4.4%以上，這主要是腌制期火腿肌肉外部滲透壓高，鹽離子迅速進入肌肉組織，同時肌肉大量失水所致。進入風干成熟階段肌肉內(nèi)部滲透壓壓差變小，火腿鹽分含量上升變得緩慢。
由表1可知，在火腿加工過程中水分含量呈顯著（p＜0.05）下降趨勢，40% KCl替代組和100%食鹽對照組各工藝點之間差異不顯著（p＞0.05），這說明采用40% KCl替代NaCl腌制對火腿加工過程中水分的散失無顯著影響（p＞0.05）。成熟中后期產(chǎn)品水分含量偏差較大，原因可能是樣品在庫房內(nèi)位置的差異造成表面失水速率有差異。
由表1可知，加工過程中火腿的pH總體略有上升。40% KCl替代組和100%食鹽對照組的pH分別從原料的5.63上升到6.02和6.09，各工藝點之間無顯著性差異（p＞0.05），成熟結(jié)束時二者差異也不顯著（p＞0.05）。Ibanez等在干腌香腸中使用KCl替代NaCl時發(fā)現(xiàn)，鹽替代對干腌香腸pH影響不顯著（p＞0.05）。各工藝點的pH偏差較大，這可能是由于原料之間差異引起的。
表1 干腌火腿加工過程中理化指標的變化
| ? | 鹽分（%） | 水分（%） | pH | |||
| ? | KCI替代組 | 食鹽對照組 | KCI替代組 | 食鹽對照組 | KCI替代組 | 食鹽對照組 |
| 原料 | 0.11±0.04cA | 0.11±0.04dA | 76.09±1.36aA | 76.09±1.36aA | 5.63±0.02bA | 5.63±0.02bA |
| 腌制結(jié)束 | 5.09±0.33bA | 4.44±0.25cA | 63.91±1.28bA | 62.76±2.37bA | 6.14±0.08aA | 6.03±0.21aA |
| 成熟30d | 5.41±0.38bB | 6.22±0.13bA | 61.89±0.70bcA | 61.33±2.26bA | 5.96±0.18aA | 5.94±0.09aA |
| 成熟60d | 6.57±0.51aA | 6.58±0.38abA | 60.49±1.05cA | 57.53±2.47cA | 6.00±0.14aA | 6.06±0.14aA |
| 成熟100d | 6.82±0.15aA | 6.72±0.17aA | 57.41±2.41dA | 54.60±1.87cA | 6.02±0.08aA | 6.09±0.19aA |
注：結(jié)果以平均值±標準差表示，同列不同小寫字母表示不同成熟期存在顯著差異（p<0.05）；同行不同大寫字母表示不同組別存在顯著差異（p<0.05）；表2~表3同。
表2 干腌火腿加工過程中多肽氮與氨態(tài)氮含量的變化
| ? | PeN含量（μg/g） | AN含量（μg/g） | ||
| ? | KCI替代組 | 食鹽對照組 | KCI替代組 | 食鹽對照組 |
| 原料 | 1987.33±222.78cA | 1987.33±222.78cA | 2676.43±193.34dA | 2676.43±193.34cA |
| 腌制結(jié)束 | 1776.48±184.22cA | 1864.98±116.58cA | 3002.81±234.55dA | 3093.96±113.98cA |
| 成熟30d | 2117.19±308.45cA | 1974.18±65.99cA | 5771.39±179.94cA | 5956.36±275.45bA |
| 成熟60d | 3076.91±102.38bA | 3182.96±228.26bA | 6736.34±339.22bA | 6880.29±360.10aA |
| 成熟100d | 4451.89±78.20aA | 4650.05±382.77aA | 7299.98±489.79aA | 7235.24±313.12aA |
2.2 KCl替代NaCl對干腌火腿加工過程中蛋白水解指數(shù)的影響
圖1 干腌火腿加工過程中蛋白水解指數(shù)的變化
蛋白水解指數(shù)（P.I.%）表示為非蛋白氮占總氮的比重，被廣泛用于評價加工肉制品蛋白質(zhì)降解程度，是評價火腿質(zhì)量的重要指標，經(jīng)過后熟的金華火腿P.I.%在14~20之間。由圖1可以看出，隨著工藝時間的延長，40% KCl替代組和100%食鹽對照組的蛋白質(zhì)降解程度都顯著增加（p＜0.05），且二者之間的差異不顯著（p＞0.05）。蛋白質(zhì)的降解是一個酶促反應(yīng)過程，蛋白酶的作用環(huán)境及潛在酶活力，尤其依賴于時間的積累。腌制期環(huán)境溫度低（4℃）限制了蛋白酶活力，蛋白質(zhì)水解不顯著；進入成熟期，環(huán)境溫度升高促進蛋白酶活作用，火腿肌肉中蛋白質(zhì)發(fā)生降解造成多肽、短肽及游離氨基酸的積累，蛋白水解指數(shù)迅速（p＜0.05）增長至成熟100d時的20%左右。成熟后期，蛋白水解指數(shù)增加緩慢，可能是由于肌肉中內(nèi)環(huán)境的變化造成蛋白水解酶活性下降，同時積累的肽類可能對蛋白水解過程有反向抑制作用。
2.3 KCl替代NaCl對干腌火腿加工過程中蛋白降解產(chǎn)物的影響
蛋白質(zhì)水解會產(chǎn)生大量各種類型的多肽、小肽和氨基酸，它們是火腿產(chǎn)品中主要滋味物質(zhì)及風味物質(zhì)的前體物，決定了火腿的感官品質(zhì)質(zhì)量。由表2可知，PeN含量在火腿加工過程中總體呈上升趨勢，風干成熟30 d之后顯著上升（p＜0.05）。100%食鹽對照組與40% KCl替代組趨勢一致，且無顯著差異（p＞0.05）。PeN的生成主要發(fā)生在風干成熟期，主要是因為肌原纖維蛋白大分子量蛋白片段（＞170 ku）、M-蛋白（160 ku）從風干成熟初期才開始降解，肌球蛋白（43 ku）在風干成熟末期才發(fā)生降解。PeN在成熟中后期積累量顯著升高（p＜0.05），這可能與肽酶活性升高有關(guān)?；鹜鹊鞍踪|(zhì)降解后產(chǎn)生的肽類中以小肽為主，而小肽中的二肽為主要降解產(chǎn)物。許多的二肽酶在火腿成熟中后期仍有活性，Zhao等研究金華火腿中的二肽酶（DPP）時發(fā)現(xiàn)，成熟結(jié)束時DPPⅠ的活性達到并超過加工前的水平。由表2可以看出AN在加工過程中也是逐步積累的，KCl替代組和食鹽對照組變化趨勢一致且無顯著差異（p＞0.05）。成熟初期AN含量顯著升高（p＜0.05），這可能與氨肽酶仍保持較高活力有關(guān)，AN在成熟中后期積累速度變慢，這一方面是因為氨肽酶活力降低，另一方面是因為氨基酸類物質(zhì)向其他風味物質(zhì)轉(zhuǎn)化。
2.4 KCl替代NaCl對干腌火腿加工過程中蛋白酶活性的影響
蛋白質(zhì)的降解過程是一個酶促反應(yīng)過程，組織蛋白酶B和L對肌原纖維蛋白具有廣泛的水解活性，并且它們在干腌火腿加工過程中都有活性，被認為是引起干腌火腿中蛋白質(zhì)降解和風味物質(zhì)形成的主要蛋白酶類，并對干腌火腿的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)有顯著影響。由表3可以看出，組織蛋白酶B和L潛在酶活力在KCl替代組和食鹽組間變化趨勢相近，且無顯著差異（p＞0.05）。隨著加工時間的延長，組織蛋白酶B和L的潛在酶活力都呈下降趨勢，這主要是因為隨著加工時間的延長，火腿肌肉水分含量和水分活度下降，鹽分升高，pH升高，內(nèi)部的環(huán)境條件不適宜組織蛋白酶的作用。有研究表明，當aw＜0.95時，組織蛋白酶B、L的活力下降明顯。
2.5 干腌火腿加工過程中各指標相關(guān)性分析
由表4和表5可以看出，40% KCl替代組和100%食鹽對照組干腌火腿加工過程中，隨著溫度升高，火腿水分散失，鹽分進一步滲透并且含量上升，水分與鹽分都呈極顯著負相關(guān)（p＜0.01）。隨著蛋白質(zhì)降解的累積效應(yīng)，P.I.%逐步升高，AN、PeN含量逐步增加，這三者之間都呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01）。同時，由于肌肉內(nèi)部環(huán)境越來越不適宜，組織蛋白酶B和L活性下降，表現(xiàn)為蛋白酶與水分含量的極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與鹽分含量的極顯著負相關(guān)（p＜0.01）。組織蛋白酶B和L最適宜pH為3.0~6.0，因此當?shù)鞍踪|(zhì)降解造成pH上升后，組織蛋白酶B和L活性下降，表現(xiàn)為與pH呈顯著負相關(guān)（p＜0.01）。
由以上實驗結(jié)果可知，采用40% KCl替代NaCl對原料腿進行腌制，對產(chǎn)品的水分、鹽分和pH均無顯著影響（p＜0.05）。由于摩爾質(zhì)量的不同，采用KCl部分替代NaCl是可以降低鹽含量的，但因為K+相對于Na+更易于在肌肉中擴散，且KCl部分替代NaCl能夠加快NaCl的滲透，當火腿進入高溫成熟期鹽分隨水分的擴散變慢后，股二頭肌的鹽含量并不表現(xiàn)出顯著性差異（p＞0.05）。K+有阻礙脫水的作用，但水分含量受溫度時間的影響更大，因此處理組間水分含量并未表現(xiàn)出顯著性差異（p＞0.05）。蛋白質(zhì)的降解是一個酶促反應(yīng)過程，處理組間理化條件的無差異性造成組織蛋白酶活性的無差異性（p＞0.05），繼而蛋白質(zhì)的水解程度及過程也無顯著性差異（p＞0.05）。pH主要受蛋白水解狀況的影響，因此也不受KCl替代的影響。同時，由于40%的NaCl被KCl所替代，火腿中鈉的含量可以降低40%，新工藝產(chǎn)品更利于健康。但采用KCl替代NaCl后對于鉀離子會產(chǎn)生苦味以及火腿產(chǎn)品中滋味物質(zhì)如游離氨基酸種類及含量的變化需要進一步的研究。
表3 干腌火腿加工過程中蛋白酶B和L潛在活力的變化
| ? | 組織蛋白酶B潛在活力(U/g) | 組織蛋白酶L潛在活力(U/g) | ||
| ? | KCI替代組 | 食鹽對照組 | KCI替代組 | 食鹽對照組 |
| 原料 | 11109.86±1087.13aA | 11109.86±1087.13aA | 10117.82±780.56aA | 10117.82±780.56aA |
| 腌制結(jié)束 | 6735.51±467.55bA | 6111.46±395.91bA | 6615.46±386.75bA | 6392.47±354.84bA |
| 成熟30d | 6179.29±379.45bcA | 6116.60±341.50bA | 6002.23±259.33bcA | 5551.59±403.59bcA |
| 成熟60d | 5349.47±219.06cA | 5040.78±209.16bA | 5306.89±265.00cA | 5151.08±167.19cA |
| 成熟100d | 3384.46±330.51dA | 3224.18±535.81cA | 6264.97±407.53dA | 3018.51±415.69dA |
表4 40% KCl替代組干腌火腿加工過程中各指標Pearson相關(guān)系數(shù)
| 指標 | 水分 | 鹽分 | pH | P.I% | AN | PeN | 蛋白酶B | 蛋白酶L |
| 水分 | 1 | ? | ? | ? | ? | ? | ? | ? |
| 鹽分 | -0.97** | 1 | ? | ? | ? | ? | ? | ? |
| pH | -0.71** | 0.76* | 1 | ? | ? | ? | ? | ? |
| P.I% | -0.76** | 0.75** | 0.31 | 1 | ? | ? | ? | ? |
| AN | -0.82** | 0.78** | 0.30 | 0.95** | 1 | ? | ? | ? |
| PeN | -0.63* | 0.56* | 0.13 | 0.90** | 0.81** | 1 | ? | ? |
| 蛋白酶B | 0.97** | -0.95** | -0.66** | -0.81** | -0.82** | -0.72** | 1 | ? |
| 蛋白酶L | 0.97** | -0.93* | -0.63* | -0.84** | -0.85** | -0.75** | 0.96** | 1 |
注：*表示有顯著相關(guān)性（p<0.05），**表示有極顯著相關(guān)性（p<0.01）；表5同。
表5 100%食鹽組干腌火腿加工過程中各指標Pearson相關(guān)系數(shù)
| 指標 | 水分 | 鹽分 | pH | P.I% | AN | PeN | 蛋白酶B | 蛋白酶L |
| 水分 | 1 | ? | ? | ? | ? | ? | ? | ? |
| 鹽分 | -0.95** | 1 | ? | ? | ? | ? | ? | ? |
| pH | -0.77** | 0.72* | 1 | ? | ? | ? | ? | ? |
| P.I% | -0.82** | 0.80** | 0.56* | 1 | ? | ? | ? | ? |
| AN | -0.83** | 0.86** | 0.58* | 0.93** | 1 | ? | ? | ? |
| PeN | -0.63* | 0.53* | 0.43 | 0.86** | 0.73** | 1 | ? | ? |
| 蛋白酶B | 0.94** | -0.93** | -0.73** | -0.80** | -0.78** | -0.69** | 1 | ? |
| 蛋白酶L | 0.94** | -0.93** | -0.77** | -0.83** | -0.84** | -0.72** | 0.96** | 1 |
3 結(jié)論
在干腌火腿的現(xiàn)代工藝加工過程中，采用40%KCl替代NaCl對原料腿進行腌制，對產(chǎn)品的理化特性、蛋白質(zhì)降解程度及產(chǎn)物水平、組織蛋白酶B和L的潛在酶活力無顯著影響，即對產(chǎn)品品質(zhì)如產(chǎn)品得率、鹽分含量、滋味物質(zhì)的總含量沒有顯著影響?？紤]到鹽替代后Na+含量降低更有利于身體健康，采用40%KCl替代NaCl腌制在火腿的加工中是可行的。這一結(jié)論為KCl在肉制品中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
