摘要：研究鹽濃度對(duì)香腸中pH、亞硝酸鹽、TVB－N、以及微生物等安全指標(biāo)的影響，確定最適腌制鹽濃度。結(jié)果表明：在1.5％及2.0％的鹽濃度下乳酸菌受到的抑制作用較小，且發(fā)酵開始后的前6h數(shù)量增加較快.6h后數(shù)量上升緩慢；當(dāng)鹽濃度達(dá)到2.5％～3.0％時(shí)，乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖受到一定程度的抑制；鹽濃度達(dá)到2.0％～3.0％時(shí)，大腸菌群的生長(zhǎng)繁殖受到明顯抑制；鹽濃度對(duì)菌落總數(shù)影響最大，鹽濃度在1.5％～3.0％時(shí)，隨著鹽濃度的升高，發(fā)酵6～9h后的總菌落數(shù)明顯降低。鹽濃度也影響發(fā)酵香腸pH值的變化，低鹽度（1.5％～2.0％）條件下pH值下降更快。在1.5％～3.0％的鹽濃度下，發(fā)酵6～9h后香腸的亞硝酸鹽含量隨鹽濃度的增加而增加。同時(shí)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；此外，TVB－N的含量顯然也受到鹽濃度的影響。采用2.0％～2.5％的食鹽腌制的益生菌發(fā)酵香腸具有較好的亞硝酸鹽及微生物學(xué)安全性。

　　關(guān)鍵詞：發(fā)酵；香腸；食鹽；安全性

　　發(fā)酵香腸歷史悠久，2000多年前地中海地區(qū)的古羅馬人便用碎肉加鹽、糖、香辛料等經(jīng)過自然發(fā)酵、風(fēng)干成滋香味美的香腸，如今，發(fā)酵香腸已發(fā)展成為發(fā)酵肉制品中產(chǎn)量最大的一類產(chǎn)品。在發(fā)酵過程中，乳酸菌發(fā)酵使可發(fā)酵性糖形成乳酸，降低產(chǎn)品的pH值。較低的pH值使得肉中的鹽溶性蛋白質(zhì)變性，形成具有切片性的凝膠結(jié)構(gòu)。添加食鹽和干燥過程可以降低肉制品的水分活度，益生菌發(fā)酵產(chǎn)生的厭氧環(huán)境，與低pH值共同作用，保證了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性。

　　現(xiàn)代發(fā)酵香腸的加工傾向于使用純培養(yǎng)的乳酸菌等發(fā)酵菌種，可以使生產(chǎn)過程的微生物安全性及產(chǎn)品質(zhì)量更有保障，且乳酸菌發(fā)酵的食品更有益于人體健康。研究表明，在肉制品和魚制品的發(fā)酵過程中，接種純培養(yǎng)的乳酸菌等益生菌可以降低制品的pH值，抑制腐敗微生物和大腸桿菌等的生長(zhǎng)繁殖，降低發(fā)酵肉、魚制品中的揮發(fā)性鹽基氮含量，抑制生物胺的生成和積累，改善魚制品的色澤和白度，改善肉、魚制品的風(fēng)味。另有研究指出，在蔬菜的發(fā)酵與腌制加工中，乳酸菌等益生菌可以降低亞硝酸鹽含量。

　　發(fā)酵肉腸的工藝條件的研究主要集中在發(fā)酵劑用量及配比，發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度、發(fā)酵時(shí)間等方面，而關(guān)于發(fā)酵過程中鹽濃度的作用和影響的研究較少。目前大多數(shù)發(fā)酵香腸中添加的食鹽量為3％～8％。鹽濃度對(duì)益生菌及腐敗菌具有重要的影響，此外食鹽攝入量過多會(huì)造成心腦血管疾病，特別是加大誘發(fā)高血壓的風(fēng)險(xiǎn)，低鹽食品有益于人體健康。因此，非常有必要探究能否在添加更低濃度食鹽（≤3％）的條件下生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)且食用安全有保障的發(fā)酵肉制品。

　　在前期的研究中，依據(jù)文獻(xiàn)，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了在發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間6～9h的基礎(chǔ)上，添加0.08％乳酸菌和0.04％酵母進(jìn)行混合發(fā)酵可以得到風(fēng)味品質(zhì)俱佳的發(fā)酵香腸。本試驗(yàn)擬探討在合適的發(fā)酵溫度和時(shí)間段，低鹽濃度范圍內(nèi)不同鹽濃度對(duì)理化安全指標(biāo)和微生物安全的影響，期望為發(fā)酵香腸改良生產(chǎn)工藝提供理論依據(jù)。

　　1.1.1  材料與試劑

　　新鮮豬肉：購(gòu)于湘潭某集市；乳酸菌發(fā)酵劑：3.12×109CFU/g；酵母發(fā)酵劑：3.95×109CFU/g；腸衣；1-7二氨基庚烷、丹酰氯：分析純；亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、硼砂、乙酸鋅、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、氧化鎂、硼酸、鹽酸、甲基紅－乙醇指示劑、次甲基藍(lán)指示劑：分析純；MRS培養(yǎng)基、PCA 培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、VRBA、BGLB肉湯：生化試劑。

　　1.1.2  主要儀器設(shè)備

　　電子分析天平：PTX-FA-110型；數(shù)顯酸度計(jì)：PHS-3BW型；紫外分光光度計(jì)：Cary60型；恒溫水浴鍋：HH-型；半微量定氮器：1765型；電熱鼓風(fēng)干燥箱：FN101-2型；手提式滅菌鍋：YXQ-SG46-280S型；垂直流潔凈工作臺(tái)：SCW-CJ-1F型；恒溫培養(yǎng)箱：SPX-250B-D型。

　　1.2.1  豬肉的腌制與發(fā)酵　取新鮮豬肥、瘦肉清洗干凈后，分別絞碎成肉糜；腌制劑：2.0％（g/100g·肉糜，所有配料均如此）食鹽、0.2％味精、0.3％胡椒粉、0.2％姜粉、0.2％五香粉、2.4％白糖、0.1％紅曲粉、0.1％磷酸鹽、0.8％醬油、2.4％黃酒；瘦肉糜中加入準(zhǔn)備好的腌制劑在2℃冷藏柜腌制18h，然后肥、瘦肉糜按3：5的質(zhì)量比混合，加入0.08％的乳酸菌和0.04％的酵母后灌腸，將其置于（32±1）℃、相對(duì)濕度75％～80％條件下發(fā)酵9h。

　　1.2.2  指標(biāo)分析　在瘦肉糜中添加不同量食鹽，經(jīng)過18h低溫腌制后，添加混合菌種發(fā)酵9h，以四分法取樣，分別對(duì)新鮮豬肉以及發(fā)酵0,6,9h的肉腸進(jìn)行pH、亞硝酸鹽、TVB－N以及微生物生長(zhǎng)情況的測(cè)定，以探究鹽濃度對(duì)香腸安全性指標(biāo)的影響。

　?。?）pH值的測(cè)定：取5g樣品加入20mL去離子水（pH 7.0）勻漿后震蕩30 min，再用數(shù)顯酸度計(jì)測(cè)定pH值。

　?。?）亞硝酸鹽的測(cè)定：按GB 5009.33-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》的方法二執(zhí)行。

　?。?）揮發(fā)性鹽基氮：按GB/T 5009.44-2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法半微量定氮法》執(zhí)行。

　　（4）微生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定：以無菌方式取破碎樣品25.0g,以10倍系列稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，選取2～3個(gè)適宜的稀釋度傾注或涂布平板。乳酸菌：用MPS培養(yǎng)基涂布平板，于（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h后計(jì)數(shù)；菌落總數(shù)：用PCA培養(yǎng)基傾注平板，于（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h后計(jì)數(shù)；大腸菌群：用VRBA傾倒雙層平板，于（36±1）℃培養(yǎng)（24±1）h后計(jì)數(shù)；典型和可疑菌落，用BGLB肉湯做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后計(jì)數(shù)。

　　所有試驗(yàn)重復(fù)3次。用SPSS statisx16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行均值計(jì)算及方差分析，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05即表示差異顯著。作圖采用Ｏrigin8.5。

　　如表1所示，在不同鹽濃度腌制條件下，發(fā)酵初始乳酸菌數(shù)隨鹽濃度升高而略微減少但差異不顯著（P＞0.05）。發(fā)酵6h后，鹽濃度從低到高乳酸菌數(shù)分別增長(zhǎng)到（6.07±0.12）。（5.81±0.08）,（5.72±0.15）。（5.63±0.02）lg CFU/g。繼續(xù)發(fā)酵至9h后，不同鹽濃度下乳酸菌數(shù)繼續(xù)增加，增長(zhǎng)速度和發(fā)酵6h后保持一致，低鹽濃度時(shí)乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)速度較快，隨著鹽濃度的增加，乳酸菌數(shù)增長(zhǎng)速度降低。4組中乳酸菌數(shù)在鹽濃度1.5％條件下增長(zhǎng)最快，當(dāng)鹽濃度高于2.5％時(shí)，乳酸菌的增長(zhǎng)數(shù)量發(fā)生明顯變化，說明2.5％以上的鹽濃度開始對(duì)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生鹽脅迫作用，抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)影響乳酸菌的存活率。

　　由表2可知，在發(fā)酵初始1.5％鹽濃度腌制條件下大腸菌群數(shù)明顯高于其他組，且具有顯著性差異（P＜0.05）。發(fā)酵6.9h后，不同鹽濃度下大腸菌群存在顯著的差異。1.5％鹽濃度下發(fā)酵6.9h后大腸菌群增幅最大，隨著鹽濃度的增加，大腸菌群數(shù)量增幅減少。試驗(yàn)結(jié)果顯示，肉腸的鹽濃度越高，對(duì)大腸菌群抑制性越強(qiáng)。其次，也有研究指出，乳酸菌發(fā)酵可以抑制大腸菌群的增值速度，且大腸菌群與腌制、發(fā)酵香腸生物胺的生成和積累密切相關(guān)，抑制大腸菌群的生長(zhǎng)繁殖可以顯著降低香腸中生物胺含量。腸道菌還與腌制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量相關(guān)，一般抑制腸道菌的生長(zhǎng)繁殖有利于降低腌制發(fā)酵蔬菜中的亞硝酸鹽含量。

　　如表3所示，腌制結(jié)束后3.0％鹽濃度腌制條件下菌落總數(shù)明顯低于其他組。發(fā)酵6.9h時(shí)，不同鹽濃度發(fā)酵條件下菌落總數(shù)表現(xiàn)出顯著的差異性（P＜0.05）。其規(guī)律均是隨著鹽濃度的升高而菌落總數(shù)相對(duì)變少。鹽濃度為1.5％時(shí)，菌落總數(shù)增長(zhǎng)幅度最大，當(dāng)鹽濃度增大到3.0％時(shí).9h時(shí)較6h時(shí)菌落總數(shù)略有升高但差異不大，說明3.0％鹽濃度能抑制益生菌發(fā)酵香腸中絕大部分微生物的生長(zhǎng)，與后面的pH值、亞硝酸鹽含量以及TVB-N的試驗(yàn)結(jié)果可以相互印證。

　　從上面3種微生物的生長(zhǎng)變化情況來看，鹽濃度對(duì)乳酸菌、大腸菌群、菌落總數(shù)均有負(fù)效應(yīng)，即隨著鹽濃度的增加，微生物數(shù)量相應(yīng)地下降，其中鹽濃度對(duì)菌落總數(shù)的影響最強(qiáng)，可能是香腸中大部分微生物的食鹽敏感性，導(dǎo)致隨著鹽濃度的增加，菌落總數(shù)明顯出現(xiàn)下降，并且腐敗菌及有害微生物的生長(zhǎng)也受到了抑制，有益于產(chǎn)品的品質(zhì)，這也是用食鹽腌制食物延長(zhǎng)保藏期的原理。

　　2.2  發(fā)酵過程中pH變化

　　由圖1可知，腌制結(jié)束后，各組的pH基本上同等降低，各組之間無顯著性差異。不同鹽濃度條件下發(fā)酵6h后，各組pH值均呈下降趨勢(shì)，其pH值在5.61～5.89，繼續(xù)發(fā)酵至9h后pH值進(jìn)一步降低，其pH值降低至5.51～5.79。發(fā)酵時(shí)間相同時(shí)，鹽濃度越低，pH值下降幅度越大。這表明鹽濃度顯著影響了發(fā)酵香腸pH值的下降速度。鹽濃度影響肉腸中微生物的滲透壓，當(dāng)鹽濃度為3.0％時(shí)，pH值下降幅度小，說明乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖可能受到了抑制。這個(gè)結(jié)果和前面乳酸菌及其他微生物的試驗(yàn)結(jié)果可以相互印證。一般情況下，發(fā)酵香腸的pH值都會(huì)下降，pH值的降低有利于香腸中亞硝酸鹽的降低、發(fā)酵風(fēng)味的形成及保藏。

表1 　鹽濃度對(duì)香腸乳酸菌數(shù)的影響                     lg CFU/g

　　同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

表2  鹽濃度對(duì)香腸大腸菌群數(shù)的影響                   lg CFU/g

　　同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

表3  鹽濃度對(duì)香腸菌落總數(shù)的影響                    lg CFU/g

　　同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

　　從圖2可知，在原料中添加食鹽進(jìn)行18h低溫腌制后，1.5％及2.0％鹽濃度腌制條件下殘留的亞硝酸鹽量與其他組具有顯著性差異（P＜0.05），并且亞硝酸鹽的殘留量隨著鹽濃度的增大而增加。而香腸發(fā)酵6.9h后，亞硝酸鹽殘留量與鹽濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，較低鹽濃度發(fā)酵條件下亞硝酸鹽的累積量始終低于較高鹽濃度的，說明在發(fā)酵過程中較高鹽濃度發(fā)酵條件會(huì)累積更多的亞硝酸鹽。文獻(xiàn)指出高食鹽含量肉制品中蛋白質(zhì)易與亞硝酸鹽反應(yīng)，因此使殘留的亞硝酸鹽濃度下降。本試驗(yàn)也得出一致結(jié)論，在不同鹽濃度腌制條件下，原料中的亞硝酸殘留量隨鹽度的增加而降低。而當(dāng)肉腸進(jìn)入發(fā)酵后，在乳酸菌的作用下，較高鹽濃度抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，從而可能影響乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解。文獻(xiàn)還指出亞硝酸鹽殘留量隨著香腸pH值的降低而減少，與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。此外，在一些關(guān)于酸菜發(fā)酵的文獻(xiàn)記載，乳酸菌有降低亞硝酸鹽積累的作用。

圖2  鹽濃度對(duì)香腸亞硝酸鹽含量的影響

　　從表4中可以看出，在原料中添加食鹽低溫腌制18h后，雖然數(shù)據(jù)分析顯示不同鹽濃度條件下TVB-N的含量具有顯著差別，但是實(shí)際數(shù)值差異甚微。由于TVB-N主要來源于蛋白質(zhì)的分解或者腐敗，因此在低溫腌制18h的情況下，鹽濃度對(duì)蛋白質(zhì)的腐敗影響較小，可能是低溫抑制了腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖及代謝。發(fā)酵到6h時(shí)，不同鹽濃度肉腸中的TVB-N含量增長(zhǎng)幅度隨著鹽濃度的增加而減少，較低鹽濃度增長(zhǎng)速度更快，而從6h發(fā)酵到9h后，1.5％鹽濃度發(fā)酵條件下T-VBN含量繼續(xù)升高，而其他鹽濃度發(fā)酵條件下TVB-N含量卻略有降低，其含量分別降至（2.73±0.05），（2.70±0.02）。（2.69±0.01）mg/100ｇ。TVB-N主要是由于酶和細(xì)菌的作用使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)，說明2.0％的鹽濃度就可能對(duì)腐敗微生物或蛋白酶活性有一定的抑制作用。此外，也有研究指出由于胺類能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與糖代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸反應(yīng)生成氨基酸，而使得TVB-N含量下降。

　　和前面微生物的試驗(yàn)結(jié)果相互印證，推測(cè)抑制腐敗菌和大腸菌群的生長(zhǎng)繁殖，可以降低發(fā)酵香腸中亞硝酸鹽及TVB-N的生成和積累。

　　表4  鹽濃度對(duì)香腸揮發(fā)性鹽基氮含量的影響         mg/100g

　　同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

　　研究了在1.5％～3.0％的鹽濃度條件下低溫腌制及接種人工菌種的發(fā)酵過程中香腸部分理化指標(biāo)的變化以及微生物生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)低鹽濃度亞硝酸鹽累積速度較慢，而高鹽濃度TVB-N含量累計(jì)速度更慢，雖然食鹽的添加能有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，但濃度過高可能導(dǎo)致過咸以及延遲成熟，影響肉腸的口感與品質(zhì)；另外對(duì)發(fā)酵肉腸而言,pH值過低，則會(huì)使產(chǎn)品酸度過高，在口感上讓人難以接受，而pH值過高，會(huì)使產(chǎn)品無法顯現(xiàn)出發(fā)酵肉制品特有的香味，因此，考慮到發(fā)酵肉腸的安全性以及食鹽作為調(diào)味品對(duì)風(fēng)味的影響，鹽濃度選擇2.0％～2.5％較為適宜。同時(shí)，綜合考慮亞硝酸鹽含量和微生物菌落數(shù)的變化，發(fā)酵時(shí)間以6h較為合適。

　　食鹽的濃度同樣影響香腸發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的變化、香腸的凝膠特性和質(zhì)構(gòu)以及發(fā)酵香腸的風(fēng)味，因此這也是后期試驗(yàn)亟待研究的問題。