摘要：研究發(fā)酵蔬菜汁替代化學(xué)合成亞硝酸鹽在牛肉腸中的作用效果。以木糖葡萄球菌和肉葡萄球菌作為發(fā)酵劑，不同添加量（5%、10%、15%和20 %）的菠菜汁和胡蘿卜汁為試驗(yàn)組制作牛肉腸，添加亞硝酸鹽（添加0.01%）組為對(duì)照組，通過模糊綜合評(píng)價(jià)法和牛肉腸的亞硝酸鹽含量篩選最佳蔬菜汁；比較無亞硝酸鹽蔬菜汁組、亞硝酸鹽蔬菜汁組和發(fā)酵蔬菜汁組3種不同處理方式的牛肉灌腸在貯藏期間菌落總數(shù)、TBARS值、TVB-N、pH和色差的變化。添加15 %和20%發(fā)酵菠菜汁制作的牛肉灌腸感官評(píng)價(jià)均較好，但是20%的發(fā)酵菠菜汁在24 h的亞硝酸鹽殘留量達(dá)到31.137mg/kg，超出國標(biāo)允許范圍內(nèi)，所以選擇15%的發(fā)酵菠菜汁。在貯藏過程中，添加15%發(fā)酵菠菜汁制作的蔬菜牛肉發(fā)酵腸的微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)和肉色指標(biāo)與添加0.01%亞硝酸鹽制作的牛肉灌腸相當(dāng)。本研究得出在牛肉灌腸制作中，供試菌發(fā)酵15%菠菜汁產(chǎn)生亞硝酸鹽可替代直接添加0.01%化學(xué)合成亞硝酸鹽。

　　關(guān)鍵詞：發(fā)酵蔬菜汁；牛肉灌腸；亞硝酸鹽；替代

　　發(fā)酵香腸是西方國家將其傳統(tǒng)制品與現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合而開發(fā)出的一類高檔肉制品，是指將絞碎的肉（通常為豬肉或牛肉）、動(dòng)物脂肪、鹽、發(fā)酵劑和香辛料等混合后灌進(jìn)腸衣，在自然或人工控制條件下，經(jīng)過微生物發(fā)酵作用而產(chǎn)生的具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地，且具有較長保存期的肉制品。在肉腌制時(shí)加入亞硝酸鹽能夠使肉品產(chǎn)生誘人的紅色，起到抗氧化和提高風(fēng)味的作用，對(duì)肉毒梭狀芽孢桿菌具有抑制其產(chǎn)生毒素的作用，從而保證肉制品的安全，盡管其能夠起到許多有益作用，但亞硝酸鹽能與肉制品中的次級(jí)胺作用生成N-亞硝基化合物，具有強(qiáng)致癌性，嚴(yán)重威脅著人們的健康。因此，尋找亞硝酸鹽在肉制品中的替代物是近年來國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。有研究報(bào)道肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌和一些微球菌能產(chǎn)生硝酸鹽還原酶，將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。李沛然研究表明自制發(fā)酵芹菜粉能夠作為一種替代合成型亞硝酸鈉的天然腌制劑。Krause[8]將富含硝酸鹽的蔬菜與具有硝酸鹽還原作用的肉葡萄球菌發(fā)酵系統(tǒng)反應(yīng)，生成了200 mg/kg～230 mg/kg 的亞硝酸鹽，并且加入發(fā)酵芹菜的灌腸在42d內(nèi)與加入亞硝酸鈉的灌腸在紅度方面沒有明顯差異（P＞0.05），亞硝酸鈉組在一個(gè)星期內(nèi)的亞硝酸鹽殘留量顯著高于發(fā)酵芹菜組（P＜0.05）。說明利用微生物對(duì)肉制品發(fā)酵，可以促進(jìn)肉的發(fā)色作用，減少亞硝酸鹽殘留量，從而提高肉制品的安全性。

　　本研究利用肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌混和發(fā)酵胡蘿卜汁、菠菜汁產(chǎn)生亞硝酸鹽來代替直接添加亞硝酸鹽生產(chǎn)蔬菜牛肉發(fā)酵腸，研究其替代效果，為開發(fā)這種新型食品提供理論依據(jù)。

　　1.1.1  原料

　　新鮮菠菜、紅蘿卜、牛背最長肌、天然腸衣：均購于本地的農(nóng)貿(mào)市場。

　　1.1.2  供試菌

　　肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌：購買于意大利SAC-CO公司。

　　1.1.3 主要輔料和試劑

　　玉米淀粉、胡椒粉、桂皮、八角、小茴香、良姜、陳皮、亞硝酸鹽：均為食品級(jí)；2-硫代巴比妥酸、氯仿、二氯化汞、氨基苯磺酸、鹽酸萘胺、硼酸、氧化鎂：均為分析純。

　　ZB-5 型斬拌機(jī)；HPP-9272 型電熱恒溫培養(yǎng)箱；YXD-912 型自動(dòng)控溫食品電烤爐；SP-XC-ZK01 型臺(tái)式真空包裝機(jī)；SHZ-B 型水浴恒溫振蕩器；2100 型分光光度計(jì)；FA25 型高剪切分散乳化機(jī)；LD5-2B 型低速離心機(jī)；SP-XC-SD01 型酸度計(jì)；TCPZ 型全自動(dòng)測色色差計(jì)。

　　以牛肉、菌種的添加量（肉重的0.02%）為定量，添加0.01 %亞硝酸鹽為對(duì)照組，胡蘿卜汁和菠菜汁的添加量以5%、10%、15 %、20%分別與牛肉混合制成8 組牛肉灌腸，用感官評(píng)價(jià)和亞硝酸鹽的含量為評(píng)定指標(biāo)，挑選出最佳方案進(jìn)行貯藏試驗(yàn)。

　　用最佳方案的蔬菜汁種類和添加量為定量制作3組灌腸，分別為無亞硝酸鹽陰性對(duì)照組：蔬菜汁；亞硝酸鹽陽性對(duì)照組：0.01%亞硝酸鹽、蔬菜汁；發(fā)酵試驗(yàn)組：0.02%菌種、蔬菜汁。

　　獨(dú)立真空包裝后在4℃冰箱中冷藏。分別在貯藏期的0、1、4、7、14、21d 測定3 組灌腸的菌落總數(shù)、亞硝酸鹽殘留量、TBARS值、TVB-N值、pH值、色差。

　　                     輔料   蔬菜汁、活化的菌種

　                       　↓                    ↓

　　原輔料處理→腌制→斬拌→拌料→灌制→結(jié)扎→發(fā)酵→煮制→烤制→成品

　　操作要點(diǎn)：

　　原輔料處理：牛肉去除筋腱、較厚的肌外膜切分成1 cm3小丁塊，胡蘿卜、菠菜汁經(jīng)清洗切分勻漿后置于冰箱中保鮮備用，稱量0.02 %肉重的菌種添加到50 mL 滅菌的牛奶（含1.4 %葡萄糖）中并常溫放置3 h以活化菌種，桂皮、八角、小茴香、良姜、陳皮按質(zhì)量比為1∶3∶2∶2∶1 的比例熬制香辛料水并置于冰箱中備用；

　　腌制：牛肉中加入肉重的10%香辛料水、2%鹽、1%蔗糖、2%蒜、0.2%味精、1%料酒、1%醬油、0.2%胡椒粉，攪拌均勻后置于4℃的冰箱中12h；

　　拌料：8 個(gè)試驗(yàn)組分別添加肉重的5%、10%、15%、20%的胡蘿卜汁和同水平的菠菜汁、0.02%菌種、7%淀粉并攪拌均勻，對(duì)照組添加0.01%亞硝酸鹽、7%淀粉后混勻；

　　發(fā)酵：8 個(gè)試驗(yàn)組在38℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵4 h，對(duì)照組在4℃冰箱放置4 h；

　　煮制：70 ℃～80 ℃水中煮制15 min；

　　烤制：50 ℃電烤爐中烤制30 min。

　　1.5.1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

　　10位身體狀態(tài)良好、具有一定食品科學(xué)知識(shí)的感官評(píng)定員對(duì)9個(gè)樣品進(jìn)行色澤、風(fēng)味、口感、質(zhì)地方面的感官評(píng)價(jià)。鑒于各位感官評(píng)定員對(duì)相似樣品的評(píng)價(jià)會(huì)有一定的模糊性和主觀性，為得到更客觀的實(shí)際結(jié)果，應(yīng)用模糊綜合評(píng)價(jià)方法來分析數(shù)據(jù)。

　　模糊綜合評(píng)價(jià)的數(shù)學(xué)模型：

　　設(shè)定論域U=色澤，風(fēng)味，口感，質(zhì)地；設(shè)定評(píng)語集V=很好，好，一般，差，其中，很好（4 分）、好（3分）、一般（2 分）、差（1分）；確定評(píng)價(jià)指標(biāo)權(quán)重集A=（0.2，0.2，0.3，0.3），即色澤2 分，風(fēng)味2分，口感3分，質(zhì)地3分，共10分；模糊關(guān)系綜合評(píng)判集Y = A·R，R為模糊矩陣。

　　表1 9 組牛肉灌腸的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

　　1.5.2 亞硝酸鹽含量的測定

　　參考國標(biāo)法中的分光光度法。

　　1.5.3 菌落總數(shù)的測定

　　牛肉灌腸在4℃冷藏期間測定0、1、4、7、14、21d的菌落總數(shù)，參照GB 4789.2-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)-菌落總數(shù)測定》中的方法測定。

　　1.5.4 TBARS 值的測定

　　TBARS 值的測定參照Vyncké、S覬rensen 和J覬rgensen的方法。

　　牛肉灌腸在4℃冷藏期間測定0、1、4、7、14、21d的TBARS 值。

　　1.5.5 揮發(fā)性鹽基氮的測定

　　牛肉灌腸在4℃冷藏期間測定0、1、4、7、14、21d的TVB-N，采用半微量定氮法，參考GB/T 5009.44-

　　2003《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》

　　1.5.6 酸堿度的測定

　　牛肉灌腸在4℃冷藏期間，測定0、1、4、7、14、21d的pH。精確稱量5 g灌腸碎樣，加入15 mL 蒸餾水，勻漿30 秒后測定pH。

　　1.5.7 色差測定

　　牛肉灌腸在4 ℃冷藏期間，用色差計(jì)測定0、1、4、7、14、21 d 的色差。

　　運(yùn)用Statistix8.1 分析軟件對(duì)測定指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析，比較方法為Tukey HSD，Alpha 為0.05；利用SigmaPlot10 軟件作圖。

　　2.1.1 蔬菜汁的添加量對(duì)灌腸感官品質(zhì)的影響

　　按照模糊綜合評(píng)價(jià)法對(duì)表2進(jìn)行評(píng)定。

　　表2 不同蔬菜添加量的灌腸的感官評(píng)定結(jié)果

　　注：A 為亞硝酸鹽組；B1、B2、B3、B4 分別為5 %、10%、15 %、20%的胡蘿卜汁組；C1、C2、C3、C4 分別為5 %、10 %、15 %、20 %的菠菜汁組。

　　從表2 可以看出不加蔬菜汁的亞硝酸鹽組的產(chǎn)品感官評(píng)價(jià)為很好，菠菜汁組添加5%和10%的產(chǎn)品評(píng)價(jià)均為很好或好，添加15%和20%的評(píng)價(jià)為好或一般；胡蘿卜汁組添加10%的產(chǎn)品評(píng)價(jià)為很好或好，添加15%和20%的評(píng)價(jià)為好或一般。與亞硝酸鹽對(duì)照組相比，添加菠菜汁或胡蘿卜汁的發(fā)酵腸感官品質(zhì)較差。

　　2.1.2  亞硝酸鹽的含量變化

　　亞硝酸鹽的含量變化見表3。

　　表3 不同組別灌腸亞硝酸鹽的含量     mg/kg

　　注：同列大寫字母不同表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著（P＜0.05）；同行小寫字母不同表示不同時(shí)間差異顯著（P＜0.05）。

　　由表3 可以看出，隨著時(shí)間延長，亞硝酸鹽對(duì)照組的亞硝酸鹽殘留量呈下降趨勢，差異顯著（P＜0.05）。對(duì)于蔬菜汁組，除了5 %菠菜汁組外，其余各組亞硝酸鹽殘留量隨著時(shí)間延長呈顯著上升趨勢（P＜0.05）。同一時(shí)間內(nèi)，亞硝酸鹽對(duì)照組的亞硝酸鹽殘留量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于蔬菜組（P＜0.05）。菠菜汁組在同一時(shí)間內(nèi)，隨著菠菜汁添加量的增加，亞硝酸鹽殘留量呈顯著升高的趨勢（P＜0.05），分別以添加5 %和20 %時(shí)表現(xiàn)最低和最高。胡蘿卜汁組在同一時(shí)間內(nèi)，隨著胡蘿卜汁添加量的增加，亞硝酸鹽殘留量呈現(xiàn)上升趨勢，5%和10%添加量組差異不顯著（P＞0.05），15 %和20%添加量組在12h 和24h 亞硝酸鹽殘留量差異顯著（P＜0.05）。蔬菜汁組以20 %菠菜汁在24h 測得的亞硝酸鹽殘留量最高，達(dá)到31.137mg/kg。

　　由于胡蘿卜汁組的亞硝酸鹽含量都很低，不作為貯藏試驗(yàn)的考慮對(duì)象。雖然15 %和20 %的菠菜汁的感官評(píng)價(jià)均較好且測得的亞硝酸鹽殘留量較高，但是20 %的菠菜汁在24 h 其殘留量超過了國標(biāo)規(guī)定的亞硝酸鹽殘留量，所以綜合考慮以15 %的菠菜汁添加量進(jìn)行貯藏試驗(yàn)，研究比較其與0.01 %亞硝酸鹽的菠菜牛肉灌腸的品質(zhì)優(yōu)劣。

　　2.2.1  不同組別牛肉灌腸菌落總數(shù)的變化

　　不同組別牛肉灌腸菌落總數(shù)的變化見圖1。

　　從圖1 可以看出，3組灌腸在貯藏期間，菌落總數(shù)呈顯著上升趨勢（P＜0.05），其中無亞硝酸鹽對(duì)照組的上升幅度最大。除第21 天外，亞硝酸鹽對(duì)照組與發(fā)酵試驗(yàn)組差異不顯著（P＞0.05）。以菌落總數(shù)看，利用菌種發(fā)酵菠菜汁產(chǎn)生亞硝酸鹽在抑菌效果方面與添加化學(xué)合成亞硝酸鹽相當(dāng)。貯藏4d內(nèi)菌落總數(shù)增長緩慢，原因是在真空包裝環(huán)境下，微生物要重新調(diào)整代謝以適應(yīng)缺氧環(huán)境；4d后菌落增長速度加快。

　　注：不同大寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著（P＜0.05）；小寫字母不同表示不同時(shí)間差異顯著（P＜0.05）

　　2.2.2 不同組別牛肉灌腸亞硝酸鹽殘留量的變化

　　不同組別牛肉灌腸亞硝酸鹽殘留量的變化見圖2。

　　注：不同大寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著（P＜0.05）；小寫字母不同表示不同時(shí)間差異顯著（P＜0.05）。

　　從圖2 可以看出，在貯藏期內(nèi)，3 組灌腸的亞硝酸鹽殘留量差異顯著（P＜0.05），亞硝酸鹽組最高，不添加亞硝酸鹽組最低，隨著貯藏期的延長，亞硝酸鹽殘留量有逐漸升高的趨勢（P＜0.05），這是因?yàn)樵谫A藏期間菠菜與細(xì)菌作用產(chǎn)生了微量的亞硝酸鹽。亞硝酸鹽組在貯藏14d 后亞硝酸鹽下降緩慢，殘留量接近46 mg/kg。發(fā)酵組中亞硝酸鹽的含量均低于亞硝酸鹽組，高于無亞硝酸鹽組，在第1 天時(shí)最高，接近29 mg/kg，隨后下降趨勢顯著（P＜0.05），符合國際亞硝酸鹽殘留量低于30mg/kg 的規(guī)定?？梢姡l(fā)酵組優(yōu)于亞硝酸鹽組。

　　2.2.3 不同組別牛肉灌腸TBARS 值的變化

　　不同組別牛肉灌腸TBARS 值的變化見圖3。

　　注：不同大寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著（P﹤0.05）；小寫字母不同表示不同時(shí)間差異顯著（P﹤0.05）。

　　TBARS 是檢測油脂氧化產(chǎn)物丙二醛的含量反映樣品的氧化程度，數(shù)值越大，脂質(zhì)氧化越嚴(yán)重。3 組灌腸的TBARS 值都隨時(shí)間的延長而增大（P﹤0.05），同一時(shí)間內(nèi)，無亞硝酸鹽組TBARS 數(shù)值最大，脂質(zhì)氧化程度最高；除第21 天外，發(fā)酵組與亞硝酸鹽組TBARS值差異不顯著（P﹤0.05），表明通過菌種發(fā)酵可以抑制脂質(zhì)過氧化。

　　2.2.4 不同組別牛肉灌腸TVB-N 值的變化

　　不同組別牛肉灌腸TVB-N 值的變化見圖4。

　　注：不同大寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著（P﹤0.05）；小寫字母不同表示不同時(shí)間差異顯著（P﹤0.05）。

　　揮發(fā)性鹽基氮值是表示肉制品新鮮度的一個(gè)指標(biāo)，數(shù)值越大，新鮮度越低。國家規(guī)定：鮮肉≤ 20 mg/100g；變質(zhì)肉> 20 mg/100g。由圖4 可以看出，3組灌腸的TVB-N 值隨貯藏時(shí)間的延長均呈上升趨勢（P＜0.05），7d 前，上升緩慢，后期上升速度加快。同一貯藏期內(nèi)，無亞硝酸鹽組TVB-N 值最大，發(fā)酵組次之，亞硝酸鹽組最小。第21 天時(shí)，3 組灌腸的TVB-N 值都低于15 mg/100g，鮮度在鮮肉范圍內(nèi)，這是真空包裝、低溫冷藏和亞硝酸鹽可抑菌等共同作用延緩了腐敗變質(zhì)。無亞硝酸鹽組因亞硝酸鹽含量微乎其微，新鮮度比另外兩組差。

　　2.2.5 不同組別灌腸制品pH的變化

　　不同組別灌腸制品pH的變化見圖5。

　　注：不同大寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著（P﹤0.05）；小寫字母不同表示不同時(shí)間差異顯著（P﹤0.05）。

　　從圖5 可以看出，3組灌腸在貯藏1d時(shí)pH下降，隨后均呈上升的趨勢（P＜0.05），但上升幅度不大。在同一貯藏期內(nèi)，貯藏時(shí)間超過1 天后發(fā)酵組的pH比無亞硝酸鹽組和亞硝酸鹽組的都低，基本上都低于6.0，這更助于亞硝酸鹽發(fā)揮抑菌作用和呈色作用。

　　2.2.6 不同組別灌腸制品a* 值的變化

　　不同組別牛肉灌腸a* 值的變化見圖6。

　　注：不同大寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著（P﹤0.05）；小寫字母不同表示不同時(shí)間差異顯著（P﹤0.05）。

　　牛肉的顏色是紅色的，由于菠菜汁的添加，3 組灌腸的顏色總體偏向綠色。由圖6 可知，除第21 天外，a*值都是負(fù)值。除第14 天外，發(fā)酵組與亞硝酸鹽組a* 值差異不顯著（P＞0.05）；發(fā)酵組與亞硝酸鹽組a* 值差異顯著（P﹤0.05）?？傮w來看，a* 值有上升趨勢，以無亞硝酸鹽組更為明顯（P＜0.05）。a* 值變化與葉綠素的降解和亞硝酸鹽的顯色作用有關(guān)。

　　2.2.7 不同組別牛肉灌腸b* 值的變化

　　不同組別牛肉灌腸b* 值的變化見圖7。

　　注：不同大寫字母表示同一指標(biāo)不同處理間差異顯著（P﹤0.05）；小寫字母不同表示不同時(shí)間差異顯著（P﹤0.05）。

　　b*值表示黃藍(lán)，正值是偏向黃色，負(fù)值偏向藍(lán)色。b*值越大，肉的色澤感覺越差。由圖7 可以看出，在貯藏期間，3組灌腸的b*值都是正值，且呈現(xiàn)波浪狀的變化。在整個(gè)貯藏期間，不同組之間的差異顯著性不斷在改變。b*值上的差異與菠菜中各色素的變化有關(guān)，葉綠素性質(zhì)不穩(wěn)地，隨貯藏時(shí)間的延長不斷損失，使呈黃色的類胡蘿卜素占優(yōu)勢，即菠菜逐漸由綠色變?yōu)辄S色。

　　本研究中，相同添加水平的胡蘿卜汁組和菠菜汁組，灌腸產(chǎn)品的感官綜合評(píng)價(jià)基本相同，菠菜汁組灌腸亞硝酸鹽產(chǎn)生量是胡蘿卜汁組的10 倍以上，但是比亞硝酸鹽組亞硝酸鹽殘留量更低，兼顧健康和產(chǎn)品品質(zhì)的要求，選擇菠菜汁組。在菠菜汁組， 15 %添加量和20 %添加量組感官綜合評(píng)價(jià)和亞硝酸鹽殘留量均高，但是20 %添加量組在24h 的亞硝酸鹽殘留量超出了國標(biāo)規(guī)定的范圍，所以，在制作蔬菜牛肉發(fā)酵腸時(shí)，選擇15%菠菜汁。

　　在酸性環(huán)境下，灌腸中的一些還原性物質(zhì)將亞硝酸鹽分解成NO，其與肌紅蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白，肌紅蛋白越多，消耗的亞硝酸鹽就越多。牛肌肉中肌紅蛋白的含量與品種、年齡、性別、運(yùn)動(dòng)量、肌肉部位有關(guān)。年齡越大、運(yùn)動(dòng)量越多的公牛含更多的肌紅蛋白，牛的部位中腿肉、臀肉比里脊、眼肉、外脊多。肉中的pH會(huì)影響到亞硝酸鹽與肌紅蛋白的呈色作用，pH在5.6～6.0 能更好地發(fā)色。同時(shí)牛肉越新鮮、腌制溫度越高、時(shí)間越長亞硝酸鹽的殘留量也越少。亞硝酸鹽也可作為抗氧化劑抑制脂質(zhì)氧化，脂肪含量也影響其殘留量。

　　選擇15 %菠菜汁制作的蔬菜牛肉發(fā)酵腸在貯藏過程中，其微生物指標(biāo)、理化指標(biāo)和肉色指標(biāo)與添加0.01%亞硝酸鹽制作的牛肉灌腸相當(dāng)。在牛肉灌腸制作中，供試菌發(fā)酵15%菠菜汁產(chǎn)生亞硝酸鹽可替代直接添加0.01%化學(xué)合成亞硝酸鹽。