摘要：為研究不同包裝方式對冷鮮雞肉貯藏期間菌群組成的影響，本文利用Illumina MiSeq高通量測序分析了不同包裝方式下的微生物多樣性。結(jié)果表明，在4℃冷藏期間，MAP，VP和N2包裝能顯著降低微生物數(shù)量和揮發(fā)性鹽基氮含量。高通量測序表明冷鮮雞肉貯藏初期菌種豐富度高，貯藏后期優(yōu)勢菌屬逐漸演變?yōu)榧賳伟鷮佟h(huán)絲菌屬、不動桿菌屬和希瓦氏菌屬，說明它們能耐受較低的溫度。與PP組相比，MAP組假單胞菌屬和不動桿菌屬的豐度分別降低14.8%和9.2%，而N2組不動桿菌屬和希瓦氏菌屬的豐度分別降低9.6%和7.4%。VP組不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬豐度下降8%和5.6%。不同包裝方式對冷鮮雞肉中的菌群影響較大，三種包裝均能抑制不動桿菌屬的生長，氣調(diào)包裝對假單胞菌屬抑制效果較好，而充氮包裝和真空包裝對希瓦氏菌屬和環(huán)絲菌屬有較好的抑制效果，本研究也為未來冷鮮雞肉所采用的包裝方式提供理論基礎(chǔ)。

　　關(guān)鍵詞：冷鮮雞；氣調(diào)包裝；充氮包裝；真空包裝；微生物多樣性
 

　　雞肉是人們餐桌上的食用佳品，其營養(yǎng)價值高，風(fēng)味獨特，脂肪含量低，是全球銷售量最大的肉類之一。但是由于肉類的水分含量高、營養(yǎng)成分豐富等因素，為微生物快速繁殖提供了有利條件。特別是具有高腐敗潛力的細菌的生長繁殖，可對肉類和肉制品產(chǎn)生有害影響，例如變色、產(chǎn)生難聞氣味和粘液。通常托盤包裝、氣調(diào)包裝、充氮包裝和真空包裝等結(jié)合低溫處理的貯藏方式，是保存冷鮮雞肉的重要方法。因為它不僅可以抑制優(yōu)勢腐敗微生物的生長，還可以改善肉制品的品質(zhì)和色澤。高磊等研究發(fā)現(xiàn)氣調(diào)包裝能明顯抑制冷鮮雞中微生物的生長繁殖，提高產(chǎn)品品質(zhì)。
 

　　但是腐敗微生物群落的整體組成是多種多樣的，主要由肉類所貯藏的環(huán)境決定的。細菌種群組成與使用不同的包裝方式貯藏有關(guān)。因此確定貯藏期間的微生物菌群是十分有必要的。賴宏剛等發(fā)現(xiàn)真空包裝冷鮮雞中腐敗菌微生物以假單胞菌屬、乳酸菌屬、環(huán)絲菌屬等為主。Liang等在托盤包裝的雞肉產(chǎn)品中檢測到不動桿菌屬、假單胞菌屬、肉芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬等細菌。Huang等通過檢測常溫和氣調(diào)包裝雞肉中細菌群落的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)貯藏7 d后，假單胞菌屬迅速繁殖并成為主要腐敗生物，相對豐度占整個菌群的90%以上。
 

　　雖然已有關(guān)于不同包裝方式對冷鮮雞微生物菌群影響的研究，但是其未對不同包裝方式進行系統(tǒng)的比較。另外，以傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法評估微生物多樣性局限性太大，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，利用16S rDNA的高通量測序研究微生物菌群越來越受到關(guān)注，高通量測序技術(shù)已成為微生物群落動態(tài)分析的常用研究工具。因此本研究以冷鮮雞肉為研究對象，研究冷鮮雞肉在不同包裝條件下的保鮮效果，同時使用16S rDNA的高通量測序研究冷鮮雞肉貯藏前期和后期微生物菌群的變化規(guī)律。研究結(jié)果將為食品行業(yè)在延長冷鮮雞肉貨架期提供理論信息。
 

　　1 材料與方法
 

　　1.1 材料與儀器

　　DNA提取試劑盒、凝膠回收試劑盒；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、氯化鈉、碳酸鉀；脂糖、FastPfu Taq酶（100 U）；硼酸；阿拉伯膠；甲基紅指示劑、次甲基藍指示劑；鮮雞胸肉。
 

　　SH-450立式氣調(diào)包裝機；GI100T高壓滅菌鍋；B1-150A生化培養(yǎng)箱。
 

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 樣品制備　冷鮮雞胸肉從南京某商超購買，并立即將其放在4℃的恒溫冰盒中1 h內(nèi)送到實驗室。將所有雞胸肉以100 g一份無菌分裝為四組，每組三個平行，放進18 cm×10 cm×5.5 cm的聚丙烯食品級無菌包裝盒中，按照實驗要求分批進行托盤包裝（PP）、氣調(diào)包裝（MAP，80%N2/20%CO2）、真空包裝（VP，VAC≥600～1333 Pa）和充氮包裝（N2，N2≥99.9%）。然后分別放入在4℃的冰箱中冷藏貯存7 d。收集樣品進行菌落總數(shù)計數(shù)、總揮發(fā)性鹽基氮測定并提取微生物基因組DNA并進行多樣性分析。
 

　　1.2.2 菌落總數(shù)計數(shù)　將指定的樣品（10 g）放入含有90 mL 0.85%無菌生理鹽水的均質(zhì)袋中，并在袋中均質(zhì)2 min。根據(jù)實驗需要，勻漿被適當(dāng)?shù)剡B續(xù)梯度稀釋，然后將0.1 mL適當(dāng)稀釋液的等分試樣一式三份分布在平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上。在37℃下培養(yǎng)48 h后對總活菌數(shù)（TVC）進行計算。
 

　　1.2.3 總揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）將10 g碎雞肉樣品放入裝有90 mL蒸餾水的三角形瓶中，然后搖晃30 min。此后，使用定性濾紙過濾所得樣品。最后按照國標(biāo)方法（GB 5009.228-2016）測定TVB-N含量。
 

　　1.2.4 DNA提取　使用細菌基因組提取試劑盒從不同處理組的冷鮮雞樣品中提取總菌的基因組DNA。對上述獲得的DNA都要進行完整性和純度分析的工作，確保其DNA滿足后續(xù)的操作要求。此步驟利用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行DNA的質(zhì)量檢測和濃度量化。
 

　　1.2.5 PCR擴增　利用引物（338F：ACTCCTACGGG AGGCAGCA和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴增16S rDNA基因的V3～V4區(qū)可變區(qū)。PCR擴增體系（20 μL）和反應(yīng)程序按照FastPfu Taq酶的說明書進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后，利用凝膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段。
 

　　1.2.6 測序和數(shù)據(jù)分析　來自每個樣品的 PCR產(chǎn)物送至奧維森公司基因科技有限公司利用IlluminaMiSeq300進行測序和分析。使用QIIME軟件分析測序數(shù)據(jù)，以細菌序列相似性至少為97%的操作分類單元（OTU）為標(biāo)準(zhǔn)，從原始數(shù)據(jù)中進行讀取后，進行篩選，質(zhì)量過濾，修剪掉低質(zhì)量序列，嵌合體檢查等一系列工作?；贠TU聚類結(jié)果利用Mothur軟件進行Alpha多樣分析。使用R語言工具統(tǒng)計和作Veen，主成分分析圖和生成熱圖。
 

　　1.3 數(shù)據(jù)處理

　　使用SPSS軟件進行結(jié)果進行統(tǒng)計分析。所有分析均使用最小顯著性差異（LSD）方法檢驗，顯著性水平為0.05。所有結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用R語言進行PCA 統(tǒng)計、分析和作圖。
 

　　2 結(jié)果與分析
 

　　2.1 不同包裝條件下細菌總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮變化

　　細菌生長是導(dǎo)致貯藏過程中肉質(zhì)腐敗的重要因素。本文分析了不同包裝方式下冷鮮雞的TVC和TVB-N的變化情況。冷鮮雞樣品的平均初始TVC水平為4.17 lg CFU/g。在冷鮮雞的整個貯藏期內(nèi)，TVC逐漸增加，至第7 d時，PP組為7.02 lg CFU/g，而MAP、N2和VP組分別為6.31、6.35和6.62 lg CFU/g，它們都顯著低于PP組（P＜0.05）。結(jié)果表明，與PP組相比，MAP、N2和VP組都可以抑制冷鮮雞樣品中微生物的生長。

 

注：MAP：氣調(diào)包裝樣品；N2：充氮包裝樣品；VP：真空包裝樣品；PP：托盤包裝樣品 ；不同大寫字母表示同一包裝方式下不同貯藏天數(shù)的顯著性差異（P＜0.05）；不同小寫字母表示同一貯藏天數(shù)下不同包裝方式間顯著性差異（P＜0.05）。
 

　　TVB-N常被用作反映肉類新鮮度的主要指標(biāo)，是微生物生長的化學(xué)腐敗指標(biāo)。因此，可以根據(jù)TVB-N來判定冷鮮雞是否符合食品標(biāo)準(zhǔn)。圖1顯示了新鮮樣品的TVB-N的初始值為8.16 mg N/100 g。除PP組外，其他樣品中的TVB-N值在貯藏前3 d增加較少。此后直至貯藏后期，TVB-N值迅速增加。第7 d時，PP組的TVB-N值達到28.9 mg N/100 g。MAP、N2和VP處理組的TVB-N分別為15.87、23.33和25.67 mg N/100 g，顯著低于PP組（P＜0.05）。根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.228-2016規(guī)定，雞肉中的TVBN的含量不得超過25 mg/100 g。因此，MAP、N2處理組都可以延緩冷鮮雞的腐敗變質(zhì)，將貨架期延長至7 d以上。上述TVB-N含量的變化規(guī)律與Yang等的研究相似。TVB-N在每個樣本中隨著貯藏時間的增加而增加，TVB-N持續(xù)增加表明儲存期間冷鮮雞肉品質(zhì)的持續(xù)惡化。TVB-N的增加主要與肉糜和內(nèi)源酶引起的蛋白質(zhì)降解反應(yīng)有關(guān)，包括游離氨基酸的脫氨和脫羧、氧化物的降解和胺的氧化。這種現(xiàn)象歸因于適宜的環(huán)境有利于腐敗菌群繁殖。
 

　　2.2 操作分類單元（OTU）的表征

注：CS：第0 d的對照樣品；MAP：第7 d氣調(diào)包裝樣品；N2：第7 d充氮包裝樣品；VP：第 7 d真空包裝樣品；PP：第7 d托盤包裝樣品；表1，圖3～圖5同。
 

　　16S rDNA基因擴增子測序可以深度分析冷鮮雞微生物群落的多樣性和豐度。高通量測序會產(chǎn)生一系列錯誤或有問題的序列。為了確保結(jié)果的可靠性，經(jīng)過質(zhì)量過濾和組裝，從總共15個樣本里得到311280個有效序列，優(yōu)質(zhì)序列主要以在400～440的區(qū)間長度為主。這些序列按照97%的序列相似度聚類成OTU，共產(chǎn)生851個OTU，經(jīng)過處理后剩余804個。Venn圖（圖2）顯示了不同組的OTU分布。在CS、PP、MAP、N2和VP組中分別有598、466、532、503和455個OTU，共有的OTU為57個，說明不同包裝方式處理冷鮮雞微生物群落差異較大。
 

　　2.3 不同包裝方式對冷藏雞儲存后期的微生物多樣性的影響

　　2.3.1 alpha多樣性　通過高通量測序確定不同處理的微生物群組成（表1）?？梢钥闯鏊薪M的覆蓋率＞0.99，這意味著在樣本中檢測到幾乎所有微生物系統(tǒng)類型。通過使用相同的樣本分析α多樣性來表征冷藏雞肉在儲存期間微生物群的變化。而Shannon和Simpson指數(shù)則代表了物種存在的豐度和均勻度。貯藏至第7 d時，冷鮮雞肉的微生物組中的Shannon和 Simpson指數(shù)均顯著低于0 d（P＜0.05）。這與Jia等的其他研究一致。這可能是因為隨著貯藏時間的延長，冷鮮雞中的少數(shù)優(yōu)勢腐敗菌快速生長，在這種高度競爭的環(huán)境下，部分微生物菌群遭到淘汰。此外，優(yōu)勢細菌與其他細菌的競爭性生長也導(dǎo)致這些樣本的多樣性降低。

　　Shannon和Simpson多樣性指數(shù)差異不大。這可能是因為氣調(diào)包裝、充氮包裝或真空包裝僅對樣品中的部分優(yōu)勢腐敗菌有抑制效果，但微生物種類的數(shù)量變化不顯著，因而物種多樣性仍比較接近。
 

　　2.3.2 細菌群落組成

　　2.3.2.1 科水平　在科水平上，樣品中細菌群落的組成在貯藏過程中經(jīng)歷了顯著的波動。從圖3A中可以看出，在貯藏初期，冷鮮雞肉新鮮度較高，菌群多樣性較高，假單胞菌科所占的比例較小。優(yōu)勢菌科依次為莫拉菌科，黃桿菌科和威克斯氏菌科。不同時期的科分布差異巨大。貯藏到第7 d，在PP組中，假單胞菌科的豐度為25.46%。李斯特菌科為24.23%。莫拉菌科為22.4%。希瓦氏菌科為12.27%。在N2組中，假單胞菌科的平均豐度百分比為41.69%，李斯特菌科為31.15%，莫拉菌科為13%，希瓦氏菌科為4.83%。在VP組中，假單胞菌科的豐度為41.6%，李斯特菌科為18.6%，莫拉菌科為14.4%，希瓦氏菌科為9.8%。MAP組以李斯特菌科和希瓦氏菌科為主要的兩個科，分別占總科數(shù)的38%和13.6%。

　　2.3.2.2 屬水平　在屬的水平上，新鮮雞肉中微生物種群的主要組成部分包括不動桿菌屬，黃桿菌屬，金黃桿菌屬。4個處理組經(jīng)過7 d貯藏后，冷鮮雞肉中都能發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬。在貯藏后期，優(yōu)勢菌屬較貯藏初期有較大差別，黃桿菌、金黃桿菌屬逐漸被假單胞菌屬、環(huán)絲菌屬和希瓦氏菌屬取代。在貯藏后期，這些優(yōu)勢菌屬在冷鮮雞樣本中的占比超過群落總數(shù)的70%，最高可超過80%。有報告發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬，希瓦氏菌屬和不動桿菌屬是肉中最常見的腐敗菌屬。其中，PP組假單胞菌屬、環(huán)絲菌屬、不動桿菌屬、希瓦氏菌和沙雷氏菌屬劇增至25.45%、24.22%、22.24%、12.27%和6.18%成為優(yōu)勢菌。相較于PP組，MAP組中的假單胞菌屬數(shù)量相對較少，只占10.67%。環(huán)絲菌屬占比則上升，達到38.04%。而不動桿菌屬占比則減少，約為13.02%。N2組和VP組中的假單胞菌屬占據(jù)優(yōu)勢地位，占相對豐度的41% 以上。N2組的不動桿菌和希瓦氏菌占比較低，分別為12.78%和4.83%。VP組中環(huán)絲菌屬，不動桿菌屬和希瓦氏菌屬的相對豐度都比PP組低，比例分別為18.62%、14.26%和10%。
 

　　以上結(jié)果表明，在貯藏后期，PP組假單胞菌屬是主要的腐敗菌，這與Ercolini等研究結(jié)果一致。這是因為假單胞菌屬為嗜冷需氧菌，代謝能力強，并且假單胞菌屬還能分泌嗜鐵素，抑制其它微生物的生長，因而逐漸生長為優(yōu)勢菌種。而MAP組中其相對豐度較低，這可能是高濃度的CO2抑制了需氧細菌的呼吸作用和酶活性，從而防止冷鮮雞肉的腐敗。
 

　　環(huán)絲菌屬在貯藏初期相對豐度較低，隨著貯藏時間的延長至第7 d時，環(huán)絲菌屬逐漸變?yōu)閮?yōu)勢菌屬。其在PP組、MAP組、N2組和VP組有較高的相對豐度，占比最高可達38.04%。這是因為環(huán)絲菌屬對環(huán)境適應(yīng)能力強，在低溫條件下仍可生長繁殖。此外，環(huán)絲菌屬是一種兼性厭氧菌，在厭氧條件或有氧氣條件下都能繁殖，并產(chǎn)生偶姻、乙酸、異丁酸、2-甲基丁酸、異戊酸、乳酸、二氧化碳和乙醇等化學(xué)物質(zhì)，導(dǎo)致肉變質(zhì)，甚至變色和形成粘液。
 

　　不動桿菌屬是導(dǎo)致肉制品腐敗的主要微生物，是傳播人類病原體的重要媒介。有研究表明雞肉在冷藏貯藏期間不動桿菌屬是較為常見的菌屬。貯藏初期，不動桿菌屬的占比為 11.20%。貯藏到第 7 d時， PP組，MAP組，N2組和VP組的不動桿菌屬分別為24.22%、13.02%、12.78%和14.26%。結(jié)果表明，PP組中的不動桿菌占比大幅上升。這可能是不動桿菌屬為專性需氧菌屬，PP組中存在的大量氧氣有利于其繁殖。與PP組相比，MAP組、N2組和VP組中不動桿菌的相對豐度下降，這可能是在無氧條件下不動桿菌屬的生長受到抑制以及其他微生物生長對不動桿菌的抑制。
 

　　希瓦氏菌屬是另一種腐敗菌屬，能通過群體感應(yīng)信號分子調(diào)節(jié)生物膜的形成和腐敗基因的表達。Mai等認為希瓦氏菌是冷鮮雞中的優(yōu)勢腐敗菌，并評估了其生長潛力。在貯藏初期，希瓦氏菌的相對豐度較低。貯藏到第7 d時，PP組，MAP組，N2組和VP組中希瓦氏菌的相對豐度上升，成為了優(yōu)勢腐敗菌。這可能是希瓦氏菌屬能耐受低溫環(huán)境。另外希瓦氏菌也屬于兼性厭氧菌屬，能夠使用電子受體（如三甲基胺-N-氧化物（TMAO））來代替氧氣，在有氧或缺氧條件下都能存活。

注：選擇本研究獲得的屬水平上相對豐度在前20位的細菌。
 

　　2.3.3 樣品菌群變化的熱圖分析結(jié)果　圖4對所有樣品中的微生物多樣性的相對豐度進行深入分析。不同的顏色的深淺代表圖中每個物種的聚集度。如圖4顯示，新鮮雞肉中微生物群落沒有出現(xiàn)明顯的聚集，表明新鮮雞肉中微生物群的多樣性在第0 d最高。初始樣品的優(yōu)勢菌屬為黃桿菌屬、金黃桿菌屬、嗜冷桿菌屬。但在貯藏后期樣品中它們的豐度都明顯下降且大多數(shù)微生物群的相對豐度下降，優(yōu)勢菌屬也發(fā)生了改變。在貯藏至第7 d時，托盤包裝中假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬占據(jù)優(yōu)勢，這表明低溫環(huán)境不足以抑制假單胞菌屬和環(huán)絲菌屬的生長，這可能與托盤包裝中含有大量氧氣有關(guān)。氣調(diào)包裝中環(huán)絲菌屬顯示出高聚集度，假單胞菌屬的聚集度則較低，這表明環(huán)絲菌屬對CO2有較高的耐受性，充氮包裝和真空包裝組中假單胞菌屬的聚集度較高，造成這一現(xiàn)象的原因這可能是包裝設(shè)備不能把包裝盒中的空氣完全抽出，導(dǎo)致包裝內(nèi)存在少量空氣。包裝內(nèi)殘留的氣體有助于好氧的假單胞菌屬的生長，加速了冷鮮雞的變質(zhì)。另外，在PP、MAP、N2和VP組中假單胞菌屬豐度較高，可能是假單胞菌屬具有蛋白水解、脂肪分解、糖分解等的能力。因此，假單胞菌屬可以利用冷鮮雞肉中的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長繁殖，從而促進冷鮮雞肉的腐敗變質(zhì)。
 

　　2.3.4 冷鮮雞貯藏過程中菌群變化的主成分分析　通過主成分分析進一步揭示了4組細菌群落結(jié)構(gòu)的顯著差異（圖5）。第一主成分對樣品差異的貢獻率為64.88%，第二主成分為10.23%。貯藏初期，CS組的3個樣品在PCA圖中的距離較遠，表示樣本組成差異很大。經(jīng)過冷藏保存后，第0 d的微生物的組成與第7 d評估的樣品明顯分離，有顯著差異。這表明冷藏雞的微生物多樣性隨貯藏時間的增加而變化。充氮包裝、氣調(diào)包裝和真空包裝方式的冷鮮雞微生物多樣性都降低。采用氣調(diào)包裝的三個樣品聚集性最高，表示菌群結(jié)構(gòu)相似度高，差異性較小。PP組與MAP組、N2組和VP組的結(jié)果不同，3個樣品的分布明顯不同，表明冷鮮雞肉的微生物群落組成差異性最大。綜上所述，不同的包裝處理和貯藏時間改變了冷鮮雞中的微生物群落組成。

 

　　3 結(jié)論
 

　　本文對不同包裝條件冷鮮雞貯藏過程中腐敗相關(guān)微生物菌群的變化進行了分析。研究表明，MAP組、N2組和VP組都能顯著抑制腐敗微生物的生長（P＜0.05）。

　　同時，高通量測序分析結(jié)果表明，所有樣品在貯藏后期的微生物豐富度降低。不動桿菌屬、黃桿菌屬、金黃桿菌屬和嗜冷桿菌屬是新鮮雞胸肉中的優(yōu)勢菌屬。隨著貯藏時間的推移，構(gòu)成雞肉微生物群的各種物種之間存在潛在的競爭，部分菌屬被取代。假單胞菌屬、環(huán)絲菌屬、不動桿菌屬和希瓦氏菌屬發(fā)展為優(yōu)勢菌屬。然而，不同包裝方式貯藏的冷鮮雞樣品中的腐敗相關(guān)的微生物相對豐度存在差異。MAP組能有效控制假單胞菌屬和不動桿菌屬，而N2組能顯著降低不動桿菌屬和希瓦氏菌屬的相對豐度。VP組能使不動桿菌屬、環(huán)絲菌屬的相對豐度下降。因此，不同的包裝方式對減少相應(yīng)優(yōu)勢腐敗菌有積極作用。此外，應(yīng)進一步開發(fā)其他抗菌方法，以結(jié)合氣調(diào)，充氮或者真空包裝，進一步延長冷鮮雞的保質(zhì)期，使這種保鮮方式在肉類工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。