肉及肉制品摻假是當(dāng)前世界各國(guó)普遍關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題，肉制品摻假鑒別及定量檢測(cè)技術(shù)的研究日漸成為食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文簡(jiǎn)述了常見(jiàn)肉制品摻假形式，針對(duì)成分替代這種最常見(jiàn)的摻假形式，綜合闡述蛋白質(zhì)檢測(cè)、核酸檢測(cè)、紅外光譜及電子鼻等多種肉制品摻假鑒別檢測(cè)技術(shù)，以及基于核酸定量的肉制品摻假定量檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)各種技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了分析和討論。

　　自從2013年涉及歐洲l6國(guó)的“馬肉風(fēng)波”曝光以來(lái)，肉及肉制品摻假成為世界各國(guó)共同關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。在國(guó)內(nèi)，一些不法商販將相對(duì)廉價(jià)的馬肉、豬肉、鴨肉等肉類(lèi)原料摻入到牛肉、羊肉制品進(jìn)行銷(xiāo)售以謀取不當(dāng)利益，從而嚴(yán)重侵犯消費(fèi)者的合法權(quán)益。這些摻假肉制品的出現(xiàn)會(huì)影響消費(fèi)者的身體健康和生命安全。此外，這些摻假肉制品出口到國(guó)外會(huì)嚴(yán)重?fù)p害食品企業(yè)形象及國(guó)家信譽(yù)。因此，近年來(lái)，我國(guó)從兩個(gè)方面人手狠抓肉制品摻假，一方面是通過(guò)制定《中華人民共和國(guó)食品安全法》、《中華人民共和國(guó)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》等嚴(yán)格的法律法規(guī)約束生產(chǎn)者和經(jīng)營(yíng)者的行為；另一方面不斷開(kāi)發(fā)運(yùn)用更準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)方法，為食品監(jiān)管提供有力的技術(shù)保障和支持。
 

　　1、常見(jiàn)肉制品摻假形式

　　近年來(lái)國(guó)內(nèi)發(fā)生的肉類(lèi)摻假事件的主要摻假方式是在高價(jià)肉及肉制品中摻人廉價(jià)的肉類(lèi)原料，尤其突出的是在羊肉、牛肉制品中摻假。這種摻假方式消費(fèi)者普遍關(guān)注，事實(shí)上，肉制品摻假的方式涉及到肉制品生產(chǎn)、加工、經(jīng)營(yíng)的各個(gè)環(huán)節(jié)，方式五花八門(mén)。BALLIN將肉制品摻假或欺詐問(wèn)題歸為四類(lèi)：來(lái)源欺詐、成分替代、加工過(guò)程改變及非肉類(lèi)成分添加。來(lái)源欺詐具體是指肉品標(biāo)注的性別、年齡、養(yǎng)殖方式、地理溯源及飼料攝取等與事實(shí)不符。成分替代是指將廉價(jià)肉品替換或摻入高價(jià)肉品，這些低價(jià)肉品可能是低價(jià)可食用肉類(lèi)，如豬肉、鴨肉摻入羊肉；也可能是非食用肉類(lèi)摻假，如馬肉、狐貍?cè)?、甚至貓肉、老鼠肉摻人可食用肉中，這種摻假方式最為惡劣，消費(fèi)者可能因?yàn)槭秤眠@些未經(jīng)檢驗(yàn)檢疫的肉品而產(chǎn)生嚴(yán)重的健康隱患。加工過(guò)程改變可能涉及肉品新鮮與否、是否化凍等方面的欺詐。非肉類(lèi)成分添加可能涉及著色劑、防腐劑、香味劑的添加，以及注水、加入大豆粉等方式。
 

　　2、肉制品摻假鑒別技術(shù)

　　近1O多年來(lái)，隨著應(yīng)用現(xiàn)代儀器分析與生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，肉制品摻假鑒別技術(shù)經(jīng)歷了從宏觀到微觀、從形態(tài)識(shí)別到分子水平檢測(cè)的發(fā)展歷程，目前肉制品摻假鑒別形成了以蛋白質(zhì)檢測(cè)和以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的兩大主要檢測(cè)體系，此外，組織學(xué)方法及紅外光譜法、電子鼻等技術(shù)在肉制品摻假鑒別領(lǐng)域也都有應(yīng)用。以蛋白質(zhì)檢測(cè)為基礎(chǔ)的肉類(lèi)本質(zhì)鑒別技術(shù)包括免疫分析技術(shù)、蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。免疫分析技術(shù)主要采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，該方法是一種將抗原一抗體反應(yīng)的高特異性與酶的高效催化作用相結(jié)合的免疫分析技術(shù)，具有高靈敏度、高通量、操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)。目前用于肉類(lèi)摻假的ELISA方法主要針對(duì)肌肉和血清中的特異性蛋白標(biāo)志分子，MACEDO等通過(guò)制備抗馬、豬、雞、牛白蛋白抗血清，采用ELISA方法，鑒別漢堡中可能摻入的廉價(jià)肉類(lèi)成分。這種基于抗原一抗體反應(yīng)的免疫分析方法的最大缺憾是對(duì)于親緣關(guān)系較近的物種易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，盡管單克隆抗體能大大提高檢測(cè)特異性，但其昂貴的制備成本和繁雜的制備步驟無(wú)疑限制了其應(yīng)用。近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)被越來(lái)越多地用于肉類(lèi)真?zhèn)舞b別研究。該方法以物種或成分的特異肽段為生物標(biāo)志物，常規(guī)的研究步驟包括蛋白質(zhì)提取、利用聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、等電聚焦電泳等電泳技術(shù)分離、胰酶消化及最后的色譜.質(zhì)譜方法對(duì)肽段的分析與鑒別。SENTANDRU等采用MALDI.TOF和LC-ESI—MS／MS鑒別豬肉中摻人的雞肉成分，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到0.5％。然而，由于肉制品中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性差、含量變化范圍廣，干擾因素多等諸多原因?qū)е麓祟?lèi)技術(shù)的靈敏度較低，假陽(yáng)性率較高，且操作步驟繁瑣、檢測(cè)成本較高。

　　以核酸檢測(cè)為基礎(chǔ)的肉制品摻假鑒別技術(shù)是基于DNA序列特異性的分子生物技術(shù)，以動(dòng)物種屬間遺傳信息差異作為物種鑒別檢測(cè)靶標(biāo)的核酸檢測(cè)方法如今被廣泛應(yīng)用。與蛋白質(zhì)檢測(cè)方法相比，DNA的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性均優(yōu)于蛋白質(zhì)，因此在加工后肉制品的鑒別檢測(cè)中具有明顯優(yōu)勢(shì)，而核酸檢測(cè)方法的高靈敏度和特異性也是蛋白檢測(cè)方法無(wú)法比擬的。DNA探針雜交是最早用于食品中肉類(lèi)成分鑒別的核酸檢測(cè)方法。近l0多年來(lái)，DNA擴(kuò)增技術(shù)成為食品中肉類(lèi)種屬鑒別的核心方法，大量研究報(bào)道了基于DNA擴(kuò)增的多種核酸分析方法對(duì)肉類(lèi)本質(zhì)進(jìn)行鑒別，包括傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增¨、多重PCR、熒光PCR¨、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(RAPD)、DNA測(cè)序及基因芯片技術(shù)等。

　　核酸擴(kuò)增技術(shù)的關(guān)鍵是擴(kuò)增靶標(biāo)序列的特異性及靈敏度，線粒體DNA憑借其較高的種間多樣性及較低的種內(nèi)變異，且在細(xì)胞中拷貝數(shù)多、靈敏度高、進(jìn)化速度快等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于肉制品摻假核酸鑒別技術(shù)。細(xì)胞色素6基因、12S和16S核糖體RNA亞基及細(xì)胞色素氧化酶I基因等是常用的線粒體基因。RIPOLI等¨針對(duì)18種常見(jiàn)動(dòng)物的細(xì)胞色素b基因設(shè)計(jì)通用引物和特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而較好地對(duì)18種動(dòng)物進(jìn)行了種屬鑒別。

　　紅外光譜技術(shù)由紅外光譜儀與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，已經(jīng)成為一種方便、快捷、無(wú)損、高效的檢測(cè)技術(shù)，近些年該技術(shù)被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛應(yīng)用于食品種類(lèi)鑒定和真?zhèn)舞b別領(lǐng)域。紅外光譜一般分為近紅外、中紅外和遠(yuǎn)紅外3個(gè)區(qū)段，其中近紅外技術(shù)在肉制品摻假鑒別中應(yīng)用最為普遍。牛曉穎等采用傅里葉變換近紅外光譜分析技術(shù)對(duì)冷鮮驢肉、牛肉、羊肉和豬肉進(jìn)行了鑒別研究，通過(guò)建立和優(yōu)化驢肉、牛肉、豬肉和羊肉肉塊及大中小三個(gè)粉碎粒徑肉糜樣品的近紅外分類(lèi)模型，比較了3種監(jiān)督模式識(shí)別算法對(duì)肉類(lèi)樣品的分類(lèi)效果，研究結(jié)果表明使用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法鑒別驢肉準(zhǔn)確率可以達(dá)到100％，而馬氏距離判別和SIMCA方法較適合肉類(lèi)樣品的分類(lèi)，兩種方法均具有判別精度高、算法簡(jiǎn)單、運(yùn)算速度快等特點(diǎn)。張玉華等¨采用近紅外光譜結(jié)合主成分分析法(PCA)、判別分析法，分別建立了牛肉和羊肉中摻雜其它動(dòng)物肉的定性鑒別模型，結(jié)果表明牛肉、羊肉中摻豬肉和鴨肉模型對(duì)訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的鑒別準(zhǔn)確率均達(dá)到90％以上。

　　近年來(lái)電子鼻技術(shù)在食品鑒別行業(yè)中的應(yīng)用也日趨增多，基于其檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，電子鼻技術(shù)已成為一種有效的肉制品檢測(cè)工具，在肉制品新鮮度檢測(cè)、品質(zhì)判定和摻假檢測(cè)等方面都有應(yīng)用¨。電子鼻是由氣敏傳感器陣列、信號(hào)處理系統(tǒng)和模式識(shí)別系統(tǒng)三大部分組成的。電子鼻通過(guò)分析肉類(lèi)食品中揮發(fā)性物質(zhì)，生成的信號(hào)被傳送到信號(hào)處理系統(tǒng)進(jìn)行處理和加工，最終由模式識(shí)別系統(tǒng)對(duì)信號(hào)處理的結(jié)果作出綜合的判斷。NURJULIANA等¨采用聲表面波電子鼻檢測(cè)了肉與肉制品是否清真，并采用頂空進(jìn)樣氣質(zhì)聯(lián)用確認(rèn)其中的揮發(fā)性成分。結(jié)果表明，電子鼻能夠?qū)⒇i肉、豬肉香腸與牛肉，雞肉、雞肉香腸與羊肉進(jìn)行有效區(qū)分。然而，電子鼻技術(shù)仍處于不斷發(fā)展的階段，其在肉制品檢測(cè)中的檢測(cè)靈敏度、識(shí)別率等尚未達(dá)到令人滿意的效果。
 

　　3、肉制品摻假定量檢測(cè)技術(shù)

　　20世紀(jì)90年代，對(duì)于肉制品摻假定量檢測(cè)的探索首先采用的是蛋白質(zhì)分析方法。LIU等采用ELISA方法檢測(cè)豬肉中的熱穩(wěn)定肌肉蛋白，并對(duì)原料及加熱處理的肉制品中豬源性成分進(jìn)行定量，其檢出限達(dá)到0.05％一0.5％。MORALES等采用DD9雜交瘤細(xì)胞株針對(duì)豬肌肉蛋白構(gòu)建單克隆抗體，嘗試通過(guò)ELISA方法定量測(cè)定牛肉和雞肉中摻入的豬肉成分。MARTIN等通過(guò)瓊脂糖凝膠放射免疫擴(kuò)散(RID)和ELISA法對(duì)牛肉餡中1％～75％的豬肉參雜進(jìn)行定量，結(jié)果顯示RID定量方法的檢出限為3％一5％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差22％，回收率為105％；ELISA法的檢出限達(dá)到1％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差18％，回收率114％。然而，由于在動(dòng)物死后蛋白質(zhì)穩(wěn)定性迅速破壞，蛋白質(zhì)分析方法在加工肉制品檢測(cè)中明顯受限，因此隨著DNA檢測(cè)方法的成熟，核酸定量方法被認(rèn)為是更有效的肉制品摻假定量檢測(cè)方法心。此外，JORGE等采用重復(fù)性的PCR檢測(cè)方法定量檢測(cè)生熟牛肉餡及肉醬中的豬肉摻假。該研究通過(guò)PCR電泳條帶的光密度測(cè)定，依據(jù)光密度值與豬肉含量之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，該方法可以對(duì)加熱、未加熱的牛肉餡中的1％豬肉進(jìn)行定量。目前，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR，以不同物種線粒體基因?yàn)閿U(kuò)增靶標(biāo)基因?qū)θ庵破分械膭?dòng)物源性成分進(jìn)行種屬鑒定已發(fā)展為普遍采用的肉制品摻假檢測(cè)技術(shù)。由于線粒體基因?yàn)槎嗫截惢颍錂z測(cè)靈敏度高，可以檢出0。001％的肉類(lèi)摻假，靈敏度高固然是該方法的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)在區(qū)分無(wú)意識(shí)的交叉污染與有意識(shí)的非法添加時(shí)產(chǎn)生困擾，因此，該方法適用于肉類(lèi)摻假的篩選鑒別。肉制品摻假定量不但可以鑒別低濃度的無(wú)意交叉污染與有意非法添加，而且可以明確摻假比例。而對(duì)于無(wú)意交叉污染與有意非法添加的區(qū)分。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)給出具體的濃度限值。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)的相關(guān)報(bào)道一般只提供某種具體方法的檢出限或定量限。眾所周知，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是目前DNA定量研究的主要方法，但該技術(shù)應(yīng)用于肉制品中不同組分的定量，尚存在諸多問(wèn)題。首先，由于不法分子制售的偽劣肉制品可能摻人豬肉、馬肉、駱駝肉、鴨肉、狗肉、雞肉等低價(jià)肉品中的一種或多種，從而使與之相應(yīng)物種的標(biāo)準(zhǔn)品的配制困難重重。其次，常用于動(dòng)物源性物種鑒別的線粒體基因，在不同物種細(xì)胞中的拷貝數(shù)各不相同，因此，以線粒體為靶基因的檢測(cè)結(jié)果很難定量分析出肉制品中的動(dòng)物源性成分的組成比例。此外，目前通過(guò)熒光PCR定量技術(shù)和數(shù)字PCR定量技術(shù)可以獲得各個(gè)物種相關(guān)基因的拷貝數(shù)，然而拷貝數(shù)絕對(duì)定量對(duì)于肉制品摻假的監(jiān)管沒(méi)有實(shí)際意義。

　　盡管上述肉制品摻假定量檢測(cè)存在現(xiàn)實(shí)的困難，仍有個(gè)別報(bào)道嘗試采用熒光PCR定量方法進(jìn)行肉制品摻假定量。胡智愷等選擇擴(kuò)增物種特異性單拷貝持家基因，避免不同物種間靶標(biāo)基因拷貝數(shù)差異對(duì)定量結(jié)果的影響。通過(guò)核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，計(jì)算雞和牛的質(zhì)量與DNA濃度的比值作為牛肉、雞肉質(zhì)量與DNA濃度的比值常數(shù)；通過(guò)樣品基因組DNA擴(kuò)增后繪制的牛源性DNA和雞源性DNA擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中所含有的相應(yīng)物種的DNA含量；通過(guò)牛肉、雞肉質(zhì)量與DNA濃度的比值常數(shù)將DNA含量轉(zhuǎn)化為樣品質(zhì)量；兩個(gè)物種樣品質(zhì)量相比計(jì)算兩個(gè)物種成分的質(zhì)量百分比。作者認(rèn)為該方法實(shí)現(xiàn)了質(zhì)量水平上的成分百分比含量分析，實(shí)驗(yàn)的絕對(duì)誤差值可以控制在5％之內(nèi)。宋麗萍等根據(jù)豬的單拷貝基因口.actin和綿羊的單拷貝基因催乳素受體所設(shè)計(jì)的特異性引物，采用相同的分析方法對(duì)豬、羊混合的純瘦肉樣本中的動(dòng)物源性成分進(jìn)行定量分析，實(shí)驗(yàn)的絕對(duì)誤差值在10％之內(nèi)。顯而易見(jiàn)，核酸相對(duì)定量方法測(cè)定的是樣品中某兩種成分DNA拷貝數(shù)的比例關(guān)系，而對(duì)于食品監(jiān)管而言，需要的是一個(gè)樣品中某兩種成分的質(zhì)量百分比。上述兩個(gè)研究以樣品質(zhì)量與DNA濃度的比值為常數(shù)，將DNA拷貝數(shù)比轉(zhuǎn)換為質(zhì)量比，忽略了樣品核酸提取效率的差異對(duì)結(jié)果的影響。而核酸提取效率受諸多因素影響，如操作人員操作手法略有差異可能會(huì)造成提取效率的顯著差異，混合樣品中兩種組分的不同混合比例可能造成不同組分核酸提取效率的差異等等。此外，該研究?jī)H以少數(shù)幾次測(cè)定結(jié)果確定樣品質(zhì)量與DNA濃度的比值常數(shù)，并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果支持。

　　SONIA等采用雙重PCR半定量法測(cè)定禽肉中摻入的豬肉成分，一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增豬線粒體cytb基因和家禽特異性線粒體12SrRNA基因，瓊脂糖凝膠電泳分離兩條目的條帶，采用圖像分析軟件讀取PCR條帶的熒光強(qiáng)度。根據(jù)不同濃度預(yù)配參比樣品的擴(kuò)增結(jié)果，以豬肉成分百分含量為橫坐標(biāo)，以Ⅳ豬為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，N豬=豬熒光強(qiáng)度／(豬熒光強(qiáng)度+禽熒光強(qiáng)度)。N豬一定程度消除了核酸提取、PCR擴(kuò)增及電泳環(huán)節(jié)的不穩(wěn)定帶來(lái)的影響。其結(jié)果表明，該方法可用于定量禽肉中1％～75％的豬肉摻假，其靈敏度可以達(dá)到0.1％，多次重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.I％～7.6％之間。2014年，SONIA等采用Taqman探針熒光PCR法對(duì)漢堡、肉丸、烤腸等肉類(lèi)加工品中摻入的大豆進(jìn)行定量，分別擴(kuò)增大豆看家基因Lectin及18SrRNA基因，18SrRNA基因是真核生物共有基因，通過(guò)18SrRNA基因擴(kuò)增可以獲得樣品中所有源自真核生物的DNA的拷貝數(shù)，具有內(nèi)參比作用，可有效消除核酸提取、PCR擴(kuò)增的批次差異的影響。該方法可以對(duì)肉制品中摻入的0.01％一6％的大豆蛋白進(jìn)行定量，其重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.1％一11.3％之間，滿足食品定量檢測(cè)要求。然而，該方法的最大問(wèn)題是，由于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中無(wú)處不在的真核細(xì)胞，極易導(dǎo)致18SrRNA基因發(fā)生污染。

　　4、結(jié)語(yǔ)

　　針對(duì)不同的肉制品摻假形式進(jìn)行摻假鑒別目前已經(jīng)有多種技術(shù)手段，隨著分子生物學(xué)、光譜學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)、儀器分析等技術(shù)的不斷進(jìn)步，肉制品摻假鑒別將在快速、低成本、高靈敏度和準(zhǔn)確率等方面日臻完善。然而，由于肉制品成分多樣、肉類(lèi)加工品及熟肉制品成分的改變以及熒光PCR相對(duì)定量方法在標(biāo)準(zhǔn)品、拷貝數(shù)比與質(zhì)量含量換算之間的限制等諸多因素決定了建立能準(zhǔn)確定量、被普遍認(rèn)可的肉制品摻假定量檢測(cè)方法尚待時(shí)日。