前言
本標準按照GB/T 1.1和GB/T 20001.4給出的規(guī)則起草。
本標準由南京農(nóng)業(yè)大學提出。
本標準由中國畜產(chǎn)品加工研究會歸口。
本標準主要起草單位：南京農(nóng)業(yè)大學、上海雄圖生物科技有限公司、無錫雄圖食品安全檢測有限公司。
本標準主要起草人：王瑋、汪勁能、王艷、沈娟、譚祈峻、蔣燊。
本標準為首次發(fā)布。
使用本標準應征得發(fā)布單位同意。
1 范圍
本標準規(guī)定了時間分辨熒光免疫分析法快速檢測豬肉中氯丙嗪殘留量的方法。
本標準適用于豬肉中氯丙嗪殘留量的現(xiàn)場快速篩查測定。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。
GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
GB/T 20763 豬腎和肌肉組織中乙酰丙嗪、氯丙嗪、氟哌啶醇、丙酰二甲氨基丙吩噻嗪、甲苯噻嗪、阿扎哌隆、阿扎哌醇、咔唑心安殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法
NY/T 1897 動物及動物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控抽樣規(guī)范
3 原理
試樣中氯丙嗪與銪離子熒光微球標記的氯丙嗪抗體結合后，抑制了層析過程中抗體與硝酸纖維膜檢測線上氯丙嗪-牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)物的免疫反應，使檢測線上熒光微球發(fā)出的時間分辨熒光強度降低，通過檢測時間分辨熒光強度變化進行定量測定。
4 試劑和材料
以下所有試劑，均為分析純試劑；水為符合GB/T 6682規(guī)定的二級水。
4.1 乙腈（CH3CN）。
4.2 甲醇（CH3OH）。
4.3 氫氧化鈉（NaOH）。
4.4 正己烷（C6H14）。
4.5 十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）。
4.6 二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）。
4.7 氫氧化鈉溶液（1mol/L）：稱取4.00g氫氧化鈉，用水溶解并定容至100mL。
4.8 磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH7.2）：稱取12.90g十二水合磷酸氫二鈉和2.18g二水合磷酸二氫鈉，用水溶解并定容至1L。
4.9 氯丙嗪時間分辨熒光免疫定量試劑盒，2℃～8℃保存。
4.9.1 氯丙嗪標準物質(zhì)：純度≥98%。
4.9.2 氯丙嗪標準儲備溶液：準確稱取適量的氯丙嗪標準物質(zhì)，用甲醇配成0.1mg/mL的標準儲備溶液。
4.9.3 氯丙嗪標準工作溶液：用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液將氯丙嗪標準儲備溶液配制成濃度分別為0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL的氯丙嗪標準工作溶液。
4.9.4 氯丙嗪時間分辨熒光免疫定量檢測卡：固定有氯丙嗪-BSA偶聯(lián)物，用于樣品中氯丙嗪與銪離子熒光微球標記抗體預反應后再與氯丙嗪-BSA偶聯(lián)物反應的載體。
5 儀器和設備
5.1 時間分辨熒光檢測儀（配LED激發(fā)光源）。
5.2 恒溫孵育器：室溫～100℃，控溫精度±0.1℃。
5.3 電子天平：感量0.01g。
5.4 離心機：轉速不低于4000r/min。
5.5 組織搗碎機。
5.6 氮氣吹干裝置。
5.7 移液器：單道200μL，1000μL。
5.8 漩渦混合器。
5.9 離心管：10mL，50mL。
6 試樣制備
取新鮮或解凍的豬肉樣品約500 g，剔除筋膜，用組織搗碎機充分搗碎均勻，裝入潔凈容器中，密封，并加以標識，于-18℃以下冷凍存放。
7 樣本提取
7.1 稱取5g試樣（精確到0.01g）于50mL離心管中，加入乙腈10mL，振蕩混合5min，4000r/min離心5min。
7.2 移取上清液（7.1）8 mL于50mL離心管中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2mL，再加正己烷5mL，振蕩混合2min，4000r/min離心2min。
7.3 移取上清液（7.2）3mL于10mL試管中，于60℃水浴下氮氣吹干，加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液0.5mL，充分混合，取100μL用于分析。
8 測定步驟
8.1 氯丙嗪時間分辨熒光免疫定量試劑盒和所需試劑的溫度均應回升至常溫后方可使用，注意每種液體使用前均需搖勻。
8.2 打開時間分辨熒光檢測儀和恒溫孵育器電源開關，開機預熱10min。
8.3 將氯丙嗪時間分辨熒光免疫定量檢測卡水平放置于恒溫孵育器加熱板上，加系列標準工作溶液（4.9.3）或試樣液（7.3）100μL到對應的檢測卡加樣孔中，蓋上恒溫孵育器蓋后于37℃恒溫保持6min。
8.4 恒溫結束后，取出氯丙嗪時間分辨熒光免疫定量檢測卡，在激發(fā)波長365nm，檢測波長610nm條件下上機檢測。
9 平行試驗
按以上步驟，對同一標準溶液、同一樣品溶液均進行平行試驗測定。
10 空白試驗
除不稱取試樣外，均按上述步驟進行。
11 監(jiān)控試驗
每次測定均應做一個添加氯丙嗪標準的空白樣品。
12 結果計算
將6個濃度的氯丙嗪的標準工作溶液（0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL）和待測溶液按測定步驟（8）測定相應的時間分辨熒光強度值。根據(jù)檢測線T信號值與質(zhì)控線C信號值的比值（T/C）和標準工作溶液的自然對數(shù)值（lnc）建立標準曲線。該定標模型在0.1ng/mL～10ng/mL范圍內(nèi)是線性的。在標準曲線中獲得待測溶液中氯丙嗪含量。
試樣中氯丙嗪含量X，以質(zhì)量分數(shù)（μg/kg）表示，按式（1）計算。
（1） 式中：
ρ——從標準曲線上查得的待測溶液中氯丙嗪含量，單位為納克每毫升（ng/mL）；
V——試樣提取溶液體積，單位為毫升（mL）；
n——試樣稀釋倍數(shù)；
m——試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。
計算結果保留至小數(shù)點后兩位。
13 確證試驗
如被測樣品中氯丙嗪殘留量的值大于檢出限時，應用GB/T 20763中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法進行確證。
14 檢測方法靈敏度、準確度、精密度
14.1 靈敏度
本方法在豬肉樣品中的檢出限為0.1μg/kg，定量限為0.24μg/kg。
14.2 準確度
本方法在0.25μg/kg～10μg/kg添加濃度水平的回收率為80%～120%。
14.3 精密度
本方法的批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10%。
本標準由中國畜產(chǎn)品加工研究會于2021年2月3日發(fā)布，2021年2月3日實施。
