前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《標準化工作導(dǎo)則 第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。
本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部鄉(xiāng)村產(chǎn)業(yè)發(fā)展司提出。
本文件由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工標準化技術(shù)委員會歸口。
本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所、河南雙匯投資發(fā)展股份有限公司、唐人神集團股份有限公司、新希望六和股份有限公司、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、中糧集團營養(yǎng)健康研究院、湖北安井食品有限公司。
本文件主要起草人：張德權(quán)、惠騰、王振宇、孔保華、孟少華、劉歡、丁曉倩、單吉浩、張曉琳、潘騰、劉志斌、胡忠良。
1 范圍
本文件規(guī)定了附錄A給定的肉及肉制品中13種雜環(huán)胺的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。
本文件適用于附錄A給定的肉及肉制品中13種雜環(huán)胺的測定。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改）適用于本文件。
GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
3 原理
試樣采用乙腈提取，分散固相萃取凈化，液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀檢測，外標法定量。
4 試劑和材料
除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級水。
4.1 試劑
4.1.1 乙酸（CH3COOH）：色譜純。
4.1.2 乙腈（CH3CN）：色譜純。
4.1.3 乙酸銨（CH3COCNH4）：純度≥98%。
4.1.4 甲醇（CH3OH）：色譜純。
4.1.5 硫酸鎂（MgSO4）：優(yōu)級純。
4.1.6 無水醋酸鈉（CH3COONa）：優(yōu)級純。
4.2 材料
4.2.1 陶瓷均質(zhì)子：適用于50mL萃取管。
4.2.2 N-丙基乙二胺（PSA）：粒徑40μm～60 μm。
4.2.3 封尾C18固相萃取填料：粒徑40μm～63 μm。
4.2.4 有機相型微孔濾膜：0.22μm。
4.3 試劑配制
4.3.1 1%乙酸-乙腈溶液：量取1.0mL乙酸（4.1.1）至100mL容量瓶中，用乙腈（4.1.2）稀釋并定容至刻度，搖勻。
4.3.2 乙酸-乙酸銨緩沖液：準確稱取0.7708g乙酸銨（4.1.3），溶于100mL水中，用乙酸（4.1.1）調(diào)pH至2.90，轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。
4.4 標準品
雜環(huán)胺標準品：應(yīng)滿足附錄A的要求。
4.5 標準溶液配制
4.5.1 雜環(huán)胺標準儲備液：分別稱取10.0mg GIu-P-2、IQx、MelQ.GIu-P-1、8-MeIQx、Norharman、4,8-DiMeIQx、7,8 -DiMelQx、Harman、4,7,8 -TriMeIQx、PhIP、AaC、Trp-P-1（4.4）于100mL容量瓶中，用甲醇（4.1.4）配制成濃度為100μg/mL的儲備液；吸取10.0mL儲備液到100mL容量瓶中，用甲醇（4.1.4）稀釋為10.0μg/mL的標準儲備液，-18℃避光保存,有效期1個月。
4.5.2 混合標準工作液：分別吸取0.01mL、0.02mL、0.05mL、0.10mL、0. 20mL、0.50mL雜環(huán)胺標準儲備液（4.5.1）于100ml容量瓶中，用甲醇（4.1.4）稀釋，得到雜環(huán)胺濃度分別為1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L的混合標準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。
5 儀器設(shè)備
5.1 液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜：配有電噴霧離子源。
5.2 電子天平：感量0.0001g和0.01g。
5.3 離心機：轉(zhuǎn)速≥10 000r/min。
5.4 pH計：感量0.01。
5.5 氮氣濃縮儀。
5.6 渦旋振蕩器 。
5.7 均質(zhì)器。
5.8 色譜柱：Zorbax SB-C18（2.1mm×50mm，1.8μm）。
注：非商業(yè)聲明，此處列出的色譜柱僅供參考，不涉及商業(yè)目的，鼓勵標準使用者嘗試不同廠家的色譜柱。
6 分析步驟
6.1 試樣制備
取試樣肉及肉制品中可食部分，搗碎混勻，標識后-18℃冷凍保存。
6.2 試樣處理
6.2.1 提取
稱取搗碎試樣2g（精確至0.01g）于50mL離心管中，加入1塊陶瓷均質(zhì)子（4.2.1）和10mL水，振蕩20min；加入10mL 1%乙酸-乙腈溶液（4.3.1），振蕩15min；加入4.0g硫酸鎂（4.1.5）和1.0g無水醋酸鈉（4.1.6），渦旋混合1min。試樣提取液在4℃、10 000r/min條件下離心10min，分為上、中、下3層，上層為含雜環(huán)胺的有機溶液，中層為肉泥，下層為水和陶瓷均質(zhì)子，取上層有機溶液6mL供凈化使用。
6.2.2 凈化
向離心后的6mL待凈化有機溶液中加入0.9g硫酸鎂（4.1.5）、0.3g N-丙基乙二胺（PSA）（4.2.2）和封尾0.3g C18固相萃取填料（4.2.3），在1 000r/min條件下均質(zhì)1min，然后在4℃、10 000r/min的條件下離心5min；離心后取1.0mL上清液在30℃條件下氮氣濃縮至近干，加入0.50mL甲醇（4.1.4）溶液復(fù)溶得試樣溶液，渦旋混勻，將試樣溶液經(jīng)微孔濾膜（4.2. 4）過濾至進樣瓶，待上機測定。
6.3 測定條件
6.3.1 液相色譜參考條件
a）色譜柱：Zorbax SB-C18（2.1mm×50mm, 1.8μm）；
b）流動相：A為乙酸-乙酸銨緩沖液（4.3.2），B為乙腈（4.1.2），梯度洗脫程序參見表1；
c）流速：0.4mL/min；
d）柱溫：30℃；
e）進樣量：2.0μL。
6.3.2 質(zhì)譜參考條件
a）電離方式：電噴霧電離正離子模式（ESI+）；
b）掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；
c）干燥氣溫度：200℃；
d）干燥氣流量：10L/min；
e）霧化氣壓力：40V；
f）鞘氣溫度：260℃；
g）鞘氣流量：11Lmin；
h）毛細管電壓：正電壓4 000V；
i）噴嘴電壓：正電壓0V；
j）定性離子對、定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量見表2。
6.4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定
6.4.1 定性測定
通過液相色譜將試樣溶液進行分離后注入串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀中，得到相應(yīng)的保留時間及信號響應(yīng)值。試樣中目標化合物色譜峰的保留時間與相應(yīng)標準色譜峰的保留時間相比較，變化范圍應(yīng)在±2.5%之內(nèi)。每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個母離子和兩個子離子，而且同一檢測批次，同一化合物，樣品中目標化合物的兩個子離子的相對豐度比與濃度相當(dāng)?shù)臉藴嗜芤合啾?，其允許偏差不超過表3規(guī)定的范圍。
6.4.2 定量測定
以雜環(huán)胺混合標準工作液中雜環(huán)胺的濃度為縱坐標，以峰面積（響應(yīng)值）為橫坐標，繪制標準曲線，按照外標法進行定量。通過液相色譜將試樣溶液進行分離后注入串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀中，得到相應(yīng)的響應(yīng)值，根據(jù)標準曲線得到目標化合物的濃度。待測試樣溶液中雜環(huán)胺的響應(yīng)值應(yīng)在標準曲線范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)重新分析。重新分析時，根據(jù)超出線性范圍倍數(shù)估算稀釋倍數(shù)，用甲醇稀釋使試樣溶液濃度盡量處于線性范圍中部。雜環(huán)胺標準溶液的液相色譜圖見附錄B，特征離子質(zhì)量色譜圖見附錄C。
6.5 空白試驗
除不加試樣外，采用6.2的步驟進行平行操作。
7 結(jié)果計算和表述
試樣中雜環(huán)胺含量按公式（1）計算。
式中：
X--試樣中雜環(huán)胺含量的數(shù)值，單位為微克每千克（μg/kg）；
n--待測試樣溶液稀釋倍數(shù)；
c--根據(jù)標準曲線上計算得出的試樣溶液中雜環(huán)胺濃度的數(shù)值，單位為微克每升（μg/L）；
V--復(fù)溶后的試樣溶液體積的數(shù)值，單位為升（L）；
m--試樣質(zhì)量的數(shù)值，單位為千克（kg）。
計算結(jié)果需扣除空白值，測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。
8 回收率和精密度
在3μg/kg～30μg/kg添加濃度范圍內(nèi)的回收率為65%～100%，批內(nèi)相對標準偏差≤15%，批間相對標準偏差≤15%。
9 檢出限和定量限
檢出限和定量限見表4。
附錄A
（規(guī)范性）
13種雜環(huán)胺的信息
13種雜環(huán)胺的信息見表A.1。
附錄B
（規(guī)范性）
13種雜環(huán)胺標準溶液的液相色譜圖
13種雜環(huán)胺標準溶液的液相色譜圖見圖B.1。
標引序號說明：
1--GIu-P-2； 2--IQx； 3--MeIQ； 4--GIu-P-1； 5--8-MeIQx； 6--Norharman；7--4,8-DiMeIQx； 8--7,8-DiMeIQx；
9--Harman； 10--4,7,8-TriMelQx； 11--PhIP；12--AaC； 13--Trp-P-1。
圖B.1 13種雜環(huán)胺標準溶液的液相色譜圖（50.0μg/L）
附錄C
（規(guī)范性）
13種雜環(huán)胺標準溶液的特征離子色譜圖
13種雜環(huán)胺標準溶液的特征離子色譜圖C.1，（略）
本標準由中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2021年5月7日發(fā)布，2021年11月1日實施。
