摘要：為了抑制冷卻牛肉貯藏(0～4℃)過程中微生物的生長，延緩肉品腐敗變質(zhì)，分別采用2%乳酸、2%醋酸、1%乳酸+1%醋酸以及無菌蒸餾水(對照組)噴灑處理冷卻牛肉，用聚乙烯袋包裝后4℃貯藏，測定0、1、3、5、7、10d菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌、假單胞菌、pH值和色澤。結(jié)果表明：2%乳酸、2%醋酸、1%乳酸+1%醋酸均可有效減少冷卻牛肉中微生物，2%乳酸減菌效果最為顯著，與對照組相比，菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌、假單胞菌最高分別減少3、2、3、5個數(shù)量級，且對牛肉pH值和色澤無顯著影響(P＞0.05)。結(jié)論：2%乳酸噴霧處理明顯抑制了冷卻牛肉中微生物的生長，延長冷鮮牛肉保質(zhì)期，與傳統(tǒng)冷藏相比可延長5～7d。

　　關(guān)鍵詞：乳酸；醋酸；冷卻牛肉；微生物；減菌

　　牛肉由于蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低，味道鮮美而享有“肉中驕子”的美譽。在我國，牛肉僅次于豬肉和禽肉，位居畜禽肉類消費第三，且近年發(fā)展快，增長非常迅速。由于微生物污染導(dǎo)致其保質(zhì)期短、衛(wèi)生質(zhì)量差、食用安全性低，因此，如何抑制微生物生長、延長冷卻牛肉保質(zhì)期成為肉類學(xué)者研究的重要課題之一。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，冷鏈運輸逐漸普及和推廣，冷卻牛肉與熱鮮牛肉和冷凍牛肉相比，在肉質(zhì)、營養(yǎng)價值、衛(wèi)生等方面均顯現(xiàn)出一定優(yōu)勢，逐漸成為牛肉消費的主要趨勢。但由于冷卻牛肉在整個生產(chǎn)過程未進行殺菌措施，難以實現(xiàn)無菌操作，導(dǎo)致原料肉的初始菌量增加，嚴(yán)重縮短了冷卻牛肉的保質(zhì)期，因此延長冷卻牛肉保質(zhì)期的關(guān)鍵問題是如何降低冷卻牛肉初始菌數(shù)和抑制殘留微生物的生長。

　　健康動物的肌肉組織基本上是無菌的，但即使在最嚴(yán)格的屠宰條件下，肌肉也可能受到微生物的污染。從2013年開始，歐盟(EU)允許噴灑濃度2%～5%乳酸(Lactic acid，LA)對牛胴體進行減菌處理。在北美，利用LA或醋酸(Acetic acid，AA)溶液對肉表面進行處理，作為分割后的減菌措施，被廣泛應(yīng)用于肉類工業(yè)，以減少細菌病原體的數(shù)量。酸處理后病原菌的減少有2個因素造成，一是肉品表面細菌被直接洗去(通過物理脫位)，二是酸處理后產(chǎn)生較低pH而導(dǎo)致的抑制效應(yīng)。國外學(xué)者研究了高濃度有機酸對接種致病菌牛肉的影響，結(jié)果表明，將2%～5%有機酸噴灑或浸泡到接種微生物的樣品中可以顯著降低致病菌數(shù)量，但關(guān)于有機酸對牛肉中內(nèi)源性微生物菌群的影響研究較少。有機酸減菌已被允許應(yīng)用，但多數(shù)學(xué)者應(yīng)用浸泡法，發(fā)現(xiàn)浸泡處理導(dǎo)致肉中可溶性物質(zhì)流失嚴(yán)重，影響其風(fēng)味和色澤，且浸泡處理還導(dǎo)致交叉污染，影響減菌效果。

　　文章應(yīng)用小型噴壺噴霧處理冷卻牛肉，設(shè)置2%LA、2%AA、1%LA+1%AA以及對照(無菌蒸餾水)4個處理組，并將噴霧處理的冷卻牛肉用聚乙烯袋包裝，在0～4℃下冷藏，研究其減菌效果，以期確定最佳減菌方案，為延長冷卻牛肉的保質(zhì)期提供進一步的參考方法。

　　1.1.1  原料與試劑  新鮮牛肉：市售；LA、AA：食品級；聚乙烯袋。

　　1.1.2  主要儀器與設(shè)備  小型壓力噴霧器(250mL)；PHS-3C酸度計；SC-80色差儀；BC/BD-300G海爾電冰柜；SYQ-DSX-280型高壓蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-1F超凈工作臺；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱；ZHP-160數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱；DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱。

　　1.2  方法

　　1.2.1 減菌液的配制  分別取一定量的LA、AA用無菌蒸餾水配制成2%LA、2%AA、1%LA+1%AA(v/v)的水溶液。其中以A代表2%LA；B代表2%AA；C代表1%LA+1%AA；CK為對照組。

　　1.2.2  樣品處理  將購買的新鮮牛肉在超凈臺上分割為大小一致的肉塊，每塊約150g，然后將肉塊隨機分成4批，每批含12個樣品，3批樣品分別手動噴灑A、B、C減菌液，剩余一批為對照(CK)，噴灑無菌蒸餾水。噴灑前將小型壓力噴霧器(250mL)壓力調(diào)節(jié)一致，將配制好的減菌液(200mL)分別裝入對應(yīng)的噴霧器中，并均勻地噴灑于肉樣上，每批樣品噴灑減菌液約30mL，噴灑后，將樣品放置于白色陶瓷盤中，并在超凈臺晾置15min，每隔3min翻動一次，晾置期間超凈臺打開無菌風(fēng)，保證不同批次實驗風(fēng)速相同。晾置結(jié)束后將肉樣置于無菌均質(zhì)袋中，在(4±1)℃冰箱貯藏。在貯存0、1、3、5、7、10d后取樣檢測微生物和理化指標(biāo)。

　　1.2.3  微生物測定

　　1.2.3.1  菌落總數(shù)  按照GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》中的規(guī)定方法進行。檢測結(jié)果按照SB/T 10482-2008規(guī)定(菌落總數(shù)≤1×106cfu/g)判斷保鮮效果。

　　1.2.3.2  大腸菌群  按照GB 4789.3—2016《食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群測定》中的規(guī)定方法進行。檢測結(jié)果按照SB/T 10482—2008規(guī)定(大腸菌群≤1×104cfu/g)判斷保鮮效果。

　　1.2.3.3  假單胞菌  按SN/T 4044—2014《出口肉及肉制品中假單胞菌屬的計數(shù)方法》進行檢測。

　　1.2.3.4  嗜冷菌  嗜冷菌計數(shù)采用謝海軍等的方法稍作修改：取一定肉樣于無菌均質(zhì)袋中，加無菌蒸餾水后均質(zhì)，梯度稀釋，選擇合適的稀釋梯度接種于PCA平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，于7℃下條件下培養(yǎng)10d后計數(shù)。

　　1.2.4  pH測定  取牛肉樣品10g，按照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》進行肉樣pH測定，重復(fù)3次，取平均值。

　　1.2.5  色澤測定  色差計進行測定，用濾紙吸干表面的水分，將樣品放于光源下，分別對每個樣品的不同部位測定3次，最后取平均值，記錄L*(亮度)；a*(紅色度)；b*(黃色度)。

　　實驗結(jié)果表示為平均值()。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件進行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。繪圖使用Microsoft office Excel2007軟件。

　　2  結(jié)果與分析

　　注：A：2%LA；B：2%AA；C：1%LA+1%AA；CK：無菌蒸餾水。下圖同。

圖1  不同減菌液的減菌效果

　　圖1顯示的是噴霧處理與未噴霧處理的牛肉相比較，其菌落總數(shù)減少的情況。由圖1可以看出，A、B、C、CK處理后，分別使初始細菌數(shù)減少了85.5%、67.6%、83.6%、51.9%。這表明不同減菌液處理肉樣均有不同程度的減菌效果，且明顯地降低了肉樣的初始菌數(shù)。CK組也有減菌效果，但效果最差。酸處理組相比較，A處理減菌效果最好，C次之，B處理減菌效果最差。導(dǎo)致這一現(xiàn)象的可能原因有2個：一是水和酸在噴霧的過程中對牛肉有清洗的效果，即物理減菌，故而水和酸處理均對冷卻牛肉具有減菌效果；二是有機酸降低冷卻牛肉表面的pH，抑制了微生物的生長，而不同有機酸pH不同，其減菌效果也不同。

圖2  不同減菌液對冷卻牛肉中菌落總數(shù)的減菌效果

　　在牛肉中，由于微生物的大量繁殖導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生尸胺類物質(zhì)和毒素。因此，判斷冷鮮牛肉品質(zhì)和安全性的主要指標(biāo)是菌落總數(shù)。根據(jù)GB 16869-2008規(guī)定，菌落總數(shù)≤1×104cfu/g為新鮮肉，104～106cfu/g為次鮮肉，菌落總數(shù)≥1×106cfu/g為變質(zhì)肉。圖2為A、B、C、CK對牛肉樣品菌落總數(shù)減菌效果的折線圖，冷藏10d各處理組菌落總數(shù)均有不同程度的上升，對照組菌落總數(shù)上升最快。第0天時，各處理組之間菌落總數(shù)無顯著差異，冷藏第3天時，A處理組菌落總數(shù)為4.99lg cfu/g，未達到貨架期終點；B、C、CK處理組菌落總數(shù)分別為7.25、7.61、7.96lg cfu/g，已經(jīng)到達貨架期終點，由此可以看出2%LA減菌效果最好。冷鮮牛肉4℃貯藏的一般保存期為1～2d，當(dāng)微生物數(shù)量達到6.0lg cfu/g以上時，肉品已腐敗不能食用。使用減菌液處理后，第3天時，B、C和CK組已經(jīng)腐敗，而A處理組在第7天仍未腐敗。因此，使用2%LA對于降低冷卻牛肉微生物數(shù)量具有明顯效果，能顯著延長冷卻牛肉貨架期。

　　2.3  不同減菌液對冷卻牛肉大腸菌群的減菌效果

　　大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。圖3為各處理組在冷藏過程中的大腸菌群數(shù)量變化。貯藏0d時有機酸處理組與對照組無顯著性差異，隨著貯藏時間的延長，CK處理組大腸菌群增長速度比其他處理組增長速度較快。在貯藏第7天時，A處理組大腸菌群數(shù)量為4.0lg cfu/g，而C、B、CK處理組大腸菌群數(shù)量分別為4.56、5.95、6.39 lg cfu/g，已高于4.0lg cfu/g，根據(jù)SB/T 10482-2008規(guī)定可知肉樣已腐敗，故可以得出A對大腸桿菌的減菌效果最好。

圖3  不同減菌液對冷卻牛肉中大腸菌群的減菌效果

圖4  不同減菌液對冷卻牛肉中假單胞菌屬的減菌效果

　　假單胞菌是常溫或者冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌群(-1～25℃)。圖4為各處理組對冷卻牛肉假單胞菌的減菌效果。第0天時，4組處理的假單胞菌屬數(shù)量無顯著性差異，第5天時，A、B、C處理組假單胞菌數(shù)量顯著低于CK組。到冷藏末期(第10天)，CK組假單胞菌數(shù)量已達到7.91lg cfu/g，而A、B、C各處理組分別為5.33、5.39、5.79 lg cfu/g，顯著低于對照組，因此可以得出有機酸減菌液均可以顯著地減少冷卻肉中假單胞菌的數(shù)量。

　　2.5  不同減菌液對冷卻牛肉嗜冷菌的減菌效果

圖5  不同減菌液對冷卻牛肉中嗜冷菌的減菌效果

　　低溫雖然可以抑制微生物的生長，但嗜冷菌由于其特殊的細胞結(jié)構(gòu)和耐寒物質(zhì)，能夠承受一定的低溫，是冷藏環(huán)境中重要的腐敗微生物。由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，不同處理的牛肉中嗜冷菌數(shù)呈上升趨勢。第0天時，A、B、C、CK處理組嗜冷菌數(shù)量分別為5.00、4.93、5.30、4.86lg cfu/g，無顯著性差異，減菌效果不明顯。第5天時，CK組嗜冷菌數(shù)量顯著高于A、B、C處理組。冷藏第10天時，CK組嗜冷菌數(shù)量高達9.28lg cfu/g，A處理組為7.58 lg cfu/g，B、C分別為8.07、8.21lg cfu/g，由此可見，A處理組對嗜冷菌的減菌效果最佳。

　　2.6  不同減菌液對冷卻牛肉pH值的影響

圖6  不同減菌液對冷卻牛肉pH值的影響

　　由圖6可以看出，貯藏期間，冷卻牛肉的pH值先下降后升高。A、B、C處理能夠使牛肉樣品在貯藏過程中維持較低的pH水平，其中A和B處理組pH呈現(xiàn)先下降，后上升的趨勢，C處理組則先下降再上升然后再下降；在同一貯藏時間，對照組的pH最大。貯藏末期，各處理組pH大小分別CK＞B＞A＞C。

　　2.7  不同減菌液對冷卻牛肉色澤的影響

　　表1為不同有機酸處理組和對照組樣品色澤值的變化，冷藏時間和減菌處理對冷卻牛肉的色澤均有影響。通常有機酸處理的L*值不隨貯藏時間的變化，在同一貯藏時期，A、B、C、CK樣品的L*值變化趨勢基本一致，b*值先增大后減小再增大，而b*值上升可能是牛肉與氧氣充分接觸后，肉中的脂肪被氧化所致。A、B、C處理組a*值在貯存期間變化不顯著，而CK處理組a*值隨著貯存時間的延長而減小。第10天時，只有對照組的a*值低于14。

表1  不同減菌液對冷卻牛肉中色澤的影響

　　注：A：2%LA；B：2%AA；C：1%LA+1%AA；CK：無菌蒸餾水。表中上標(biāo)a、b、c字母代表同行不同保鮮劑處理0.05水平的差異顯著性；下標(biāo)x、y、z字母代表同列同一保鮮劑處理不同貯藏時間0.05水平的差異顯著性。

　　由于有機酸處理是生產(chǎn)過程中簡單有效的減菌技術(shù)，它們作用的原理是降低肉中pH殺死或抑制細菌的生長。文章采用2%LA、2%AA、1%LA+1%AA和無菌蒸餾水噴霧處理冷卻牛肉，使初始菌數(shù)分別降低了85.5%、67.6%、83.6%、51.9%。1983年Ande對胴體外表首先用40℃熱水噴淋，再用3%醋酸處理，細菌含量可降低96.8%。因此可以在肉牛屠宰工藝中設(shè)置有機酸減菌液噴淋胴體環(huán)節(jié)，以減少胴體表面的微生物污染，這對指導(dǎo)冷卻牛肉生產(chǎn)具有重要意義。

　　通過有機酸噴霧處理，在第0天時，A處理組菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌、假單胞菌的量分別為5.19、4.11、4.93、4.38lg cfu/g，B處理組菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌、假單胞菌的量分別為5.54、4.08、5.30、3.80lg cfu/g，C處理組菌落總數(shù)、大腸菌群、嗜冷菌、假單胞菌的量分別為5.04、3.77、4.86、4.10lg cfu/g，經(jīng)統(tǒng)計分析，在第0天時各處理組與對照組無顯著性差異(P＞0.05)。這可能是因為剛噴灑有機酸，使其沒有完全滲進肉中，導(dǎo)致減菌作用沒有完全發(fā)揮出來；再者，第0天微生物初始值較低，所以導(dǎo)致減菌效果不明顯。也有作者研究發(fā)現(xiàn)LA對肉類作用，可使菌落總數(shù)最初降幅高達2.5個對數(shù)值。在不同研究中，LA的減菌作用差異可能是由于樣品類型、取樣方法等造成的。貯存第3～7天時，有機酸減菌效果最好，尤其是LA，第7天之后，各減菌劑減菌效果逐漸減弱?？赡艿脑蚴窃?～7d隨著貯藏時間的延長，微生物的數(shù)量逐漸增多，這就使減菌效果尤為顯著；且隨著時間延長，有機酸更完全地滲透進牛肉中，有效地發(fā)揮了其減菌作用。LA減菌效果優(yōu)于AA和LA+AA混合酸，主要的原因是LA的pH值低于AA和兩者的混合物。目前也有學(xué)者研究得到相似結(jié)果。Snijders等采用對肉品噴灑食用LA減菌的方法，發(fā)現(xiàn)LA能有效降低微生物數(shù)量，并且在后期也有一定的殘留抑菌作用。Bin等采用磷酸三鈉(TSP)、LA和AA浸泡雞肉的方法，結(jié)果表明，LA對大腸桿菌和需氧菌總數(shù)的抑制作用優(yōu)于TSP和AA。Samelis等利用2%LA、2%LA及兩者與水復(fù)合(1:1，1:9，1:99)處理肉樣，發(fā)現(xiàn)LA對大腸桿菌O157:H7的殺滅效果比AA強，而AA對天然肉類微生物的殺滅效果較好。

　　假單胞菌屬為專性需氧的革蘭氏陰性菌，它在有氧環(huán)境中具有增殖快和產(chǎn)氨性能強等特點，并且生長速度幾乎不受溫度的影響。假單胞菌是嗜冷菌的一種，是肉類主要腐敗菌。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，初期假單胞菌的量和該菌在菌系中所占比例在肉品腐敗中起著重要的作用，冷藏過程中，假單胞菌初始菌量為50%，而末期會上升至90%。Nychas認(rèn)為當(dāng)肉中假單胞菌屬的數(shù)量為7～8lg cfu/g時，就能導(dǎo)致肉的腐敗，尤其當(dāng)肉中葡萄糖和乳酸及其鹽類消耗殆盡后，假單胞菌開始代謝含氮化合物，導(dǎo)致產(chǎn)品出現(xiàn)異味，肉出現(xiàn)明顯的腐敗現(xiàn)象。冷卻牛肉低溫保存雖然可延長其保質(zhì)期，但由于嗜冷菌等的存在，依然會導(dǎo)致冷卻牛肉的腐敗變質(zhì)。故而抑制嗜冷菌的生長，對延長冷卻牛肉保質(zhì)期具有重要意義。通過此次研究發(fā)現(xiàn)，有機酸對嗜冷菌及假單胞菌的減菌效果非常顯著，在第5天時，與對照相比，可減少4～5個數(shù)量級。但目前鮮有作者利用有機酸，針對肉中主要腐敗菌假單胞菌進行減菌效果及機制研究。

　　一般來說，細菌生長與鮮肉貯藏中的各種理化指標(biāo)和感官特性變化存在密切的關(guān)系。在實驗冷藏末期，A、B、C處理組pH略低于其他組，而肉樣紅度值(a*)略高于對照組，可能是有機酸抑制了肉樣中pH的升高，進而延緩肉品的腐敗，防止肉色因腐敗而變暗沉。Cristina等研究證明，使用2%～4%的LA不會對牛肉色澤產(chǎn)生不利的影響。Hoa等采用LA和AA(3%v/v)進行胴體減菌，結(jié)果表明，乳酸和醋酸均有減菌效果，且對肌肉組織的pH值、色澤、持水力無顯著性影響，這與此次研究結(jié)果一致。

　　研究采用2%乳酸、2%醋酸、1%乳酸+1%醋酸對冷卻牛肉進行噴灑處理，并檢測了微生物數(shù)量、pH和色澤等指標(biāo)。結(jié)果表明，經(jīng)過減菌液處理的樣品微生物數(shù)量均低于對照組，且2%乳酸效果尤為顯著，其對菌落總數(shù)最高可減少3個數(shù)量級；對大腸菌群最高可減少2個數(shù)量級；對假單胞最高可減少4～5個數(shù)量級；對嗜冷菌最高可減少3個數(shù)量級。因此，2%乳酸減菌液對于降低冷卻牛肉微生物污染水平具有明顯效果，與傳統(tǒng)冷藏相比可延長冷卻牛肉保質(zhì)期5～7d。因此，應(yīng)用2%乳酸減菌液噴灑牛肉可作為提高安全性的措施，這為牛肉減菌的研究提供了新的參考方法。另外，有機酸對肉品主要腐敗菌假單胞菌減菌效果較好，為以后肉品保質(zhì)期的研究開拓新的思路。