丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）；槲皮素。氯化鎂、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氯仿、甲醇、氯化鈉等試劑均為國產(chǎn)分析純。

　　1.2  儀器與設(shè)備

　　Allegra 64R冷凍離心機(jī)；FE20pH計(jì)、PL203型電子分析天平；T25數(shù)顯型均質(zhì)機(jī)；UV2550紫外-可見光分光光度計(jì)；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀；CR-400色差儀。

　　1.3  方法

　　1.3.1  肉糜制作和蛋白質(zhì)提取方法

　　1.3.1.1  肉糜制作

　　肉糜的制備在4℃冷庫中進(jìn)行。配方為：70%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）豬背最長肌、10%肥膘、18%水和2%氯化鈉。將豬肉用絞肉機(jī)絞碎后，分為5個(gè)處理組：第1組為空白組（即不添加任何抗氧化劑）；第2～4組分別添加0.05、0.10、0.20g/kg槲皮素，第5組添加0.2g/kgBHA。將0.025、0.050、0.100g槲皮素和0.10gBHA分別用2mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液溶解后，再加到肉糜中，肉糜總質(zhì)量為500g。充分混合均勻后，將肉糜制成50g的肉餅，直徑約7cm，厚度約1cm，每3個(gè)肉餅放入一個(gè)聚丙烯包裝盒中，用保鮮膜封好，置于4℃冰箱冷藏，分別在第1、3、6、9天測定各項(xiàng)指標(biāo)。

　　1.3.1.2  蛋白質(zhì)的提取與濃度的測定

　　肌原纖維蛋白提取按照Park等的方法進(jìn)行。稱取適量肉糜加入4倍體積的4℃提取液（10mmol/L磷酸緩沖溶液，含100mmol/L NaCl、2mmol/L MgCl2和1mmol/L二胺四乙酸，pH7.0），勻漿60s，離心15min（3500 r/min、4℃）。取沉淀，重復(fù)提取兩次。去上清液，用4倍體積4℃100mmol/L NaCl溶液重復(fù)清洗3次。最終用4層紗布過濾，用0.1mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，然后再冷凍離心15min（3500r/min、4℃），去上清液。稱質(zhì)量后4℃條件下冷藏。蛋白質(zhì)濃度用雙縮脲法測定，牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

　　1.3.2  硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物值的測定

　　硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物（thiobarbituric acids reactive substances，TBARS）值的測定參照J(rèn)ongberg等的方法，并做適當(dāng)修改。準(zhǔn)確稱取絞碎的豬肉糜5g，加入15mL75g/L三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-1g/L焦性沒食子酸-1g/L乙二胺四乙酸混合溶液，然后11000r/min均質(zhì)60s，4℃冷凍離心5min（3500r/min），過濾后取濾液，加2.5mL0.02mol/L硫代巴比妥酸溶液于裝有2.5mL濾液的試管中，然后沸水浴反應(yīng)50min顯色，冷卻后在532nm波長處測定吸光度（A）。TBARS值以每千克肉樣品中所含的丙二醛質(zhì)量表示，計(jì)算如式（1）所示。

　　（1）

　　式中：V 表示樣品體積/mL；M表示丙二醛的摩爾質(zhì)量（72.063g/mo l）；ε表示摩爾吸光系數(shù)（156000L/（mol·cm））；I表示光程（1cm）；m表示肉樣質(zhì)量/kg。

　　1.3.3  總巰基含量的測定

　　總巰基含量的測定按照Yang Hua等的方法并加以修改。將蛋白溶液稀釋成5mg/mL，取1mL加入8mL Tris-甘氨酸溶液，均質(zhì)后，冷凍離心15min（10 000 r/min、4℃），除去不溶性蛋白。取4.5mL上清液，加入0.5mL Ellman試劑，混勻，在室溫下避光放置30min后，在412nm波長處測定吸光度。使用摩爾吸光系數(shù)13600L/（mol·cm）計(jì)算蛋白中總巰基的含量。

　　1.3.4  羰基含量的測定

　　參考Ortu?o等的方法測定羰基含量，并略加修改。將蛋白質(zhì)溶液稀釋成5mg/mL，向3mL蛋白溶液中加入1mL10mmol/L二硝基苯肼溶液，在室溫下靜置1h（每15min振蕩一次），然后添加1mL20%TCA溶液，冷凍離心5min（10000r/min，4℃），取沉淀，用乙酸乙酯-乙醇（體積比1∶1）洗滌沉淀3次以除去未反應(yīng)的試劑，加入3mL6mol/L鹽酸胍溶液在37℃下溶解蛋白沉淀，然后冷凍離心5min（10000r/min，4℃）去除不溶物，所得的溶液在370nm波長處測定吸光度?？瞻捉M則是加入1mL 2mol/L HCl溶液。使用摩爾吸光系數(shù)22000L/（mol·cm）計(jì)算蛋白中羰基含量。

　　1.3.5  表面疏水性的測定

　　參照Chelh等的方法，取1mL 5mg/mL的蛋白溶液，加入200μL的1mg/mL溴酚藍(lán)，混勻，室溫下振蕩10min，然后離心15min（4℃、6000r/min），取上清液稀釋10倍，在595nm波長處測定吸光度，對(duì)照組為磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）替代蛋白溶液。表面疏水性可用溴酚藍(lán)結(jié)合量表征，具體計(jì)算見公式（2）。

　　（2）

　　1.3.6  肉糜顏色的測定

　　使用手持色差儀測定肉糜顏色，先將色差儀進(jìn)行校正，將肉樣放置于自然光充足的平面上，垂直將色差儀置于肉糜上方，鏡面緊扣肉面（不漏光），隨機(jī)在每個(gè)樣品3個(gè)不同的位置測定數(shù)據(jù)，分別得到L*、a*和b*值，將3次測量值的平均數(shù)作為色差讀數(shù)，重復(fù)3次。

　　1.3.7  肉糜蒸煮損失率的測定

　　準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為m1（30～35g）的均勻肉糜，填裝到50mL塑料離心管中，然后低速離心（1500r/min、4℃、5min）除氣泡，然后將肉樣置于85℃水浴鍋中，沒過肉樣蒸煮30min，蒸煮后冷卻至室溫，用濾紙吸干水分，然后稱肉糜質(zhì)量，記為m2/g。稱完后，放在4℃環(huán)境中保存。蒸煮損失率計(jì)算按公式（3）進(jìn)行。

　　（3）

　　1.3.8  熟肉糜的質(zhì)構(gòu)分析

　　將煮熟的肉糜切成直徑2cm、高度1cm的柱狀樣品。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)設(shè)定為：P50鋁合金探頭、測前速率2mm/s、測中速率1mm/s、測后速率1mm/s、間隔時(shí)間5s、觸發(fā)力5.0kg。每組6個(gè)平行，重復(fù)3次。

　　每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件中的Linear Models程序進(jìn)行處理，差異顯著性分析采用LSD程序，P＜0.05表示差異顯著。作圖使用SigmaPlot12.5軟件。

　　同一添加組、不同貯藏時(shí)間小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；

　　同一貯藏時(shí)間、不同添加組大寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

　　硫代巴比妥酸實(shí)驗(yàn)是目前應(yīng)用于監(jiān)測含油脂食品氧化酸敗最廣泛的方法之一。如圖1所示，各組肉糜的TBARS值在冷藏過程中整體呈上升趨勢(shì)，尤其是空白組，脂肪氧化程度大幅度增加，在第6天和9天時(shí)急劇升高，這可能是氧化后期初級(jí)氧化產(chǎn)物氫過氧化物大量裂解為醛、醇、酮等小分子氧化產(chǎn)物所致。添加槲皮素后，各組的TBARS值均顯著低于空白組（P＜0.05），這可能是因?yàn)殚纹に亟Y(jié)構(gòu)中B環(huán)上的3’,4’-OH基團(tuán)具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，能夠清除不飽和脂肪酸的游離基，從而阻止其生成過氧化物，有效避免了脂肪氧化。通過對(duì)比同一冷藏時(shí)間、不同槲皮素添加量之間的TBARS值，發(fā)現(xiàn)除冷藏第1天時(shí)，0.05g/kg槲皮素組的TBARS值顯著高于其他處理組（P＜0.05）之外，其他同一冷藏時(shí)間、不同添加量之間均無顯著差異（P＞0.05），且此時(shí)槲皮素組的TBARS值與BHA組之間差異也不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果說明，槲皮素能有效降低肉糜在冷藏過程中的氧化程度，但添加量對(duì)抑制氧化效果的影響不大，且其作用效果與BHA相當(dāng)。

　　在肌原纖維蛋白中，巰基含量較高且敏感性強(qiáng)，易被氧化成二硫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚合和交聯(lián)，故巰基含量可作為判定蛋白氧化程度的指標(biāo)之一。如圖2所示，各組巰基含量在冷藏過程中均逐漸降低，且冷藏第1～6天時(shí)，添加槲皮素和BHA均不能降低巰基損失的程度，說明此時(shí)二者不能有效抑制蛋白質(zhì)氧化的發(fā)生。冷藏第9天時(shí)，0.05g/kg槲皮素組的巰基含量略高于空白組，但差異不顯著（P＞0.05），0.10g/kg和0.20g/kg槲皮素組以及BHA組的巰基含量均顯著高于空白組（P＜0.05），說明隨著貯藏時(shí)間的延長，較高添加量的槲皮素對(duì)蛋白質(zhì)氧化有相對(duì)較好的抑制作用。肌原纖維蛋白中巰基含量降低是由于自由基攻擊蛋白分子導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，促使內(nèi)部包埋的巰基暴露，被氧化成二硫鍵。而槲皮素作為一種多酚物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)中的3-OH基團(tuán)與類黃酮結(jié)構(gòu)中苯氧自由基通過電子共軛和錯(cuò)位形成穩(wěn)定的平面立體結(jié)構(gòu)，可以抑制自由基的產(chǎn)生，減少巰基的損失。Procházková等證實(shí)槲皮素的高抗氧化活性取決于其2,3-雙鍵和4-羰基結(jié)合Fe2+的螯合作用，該作用可阻礙槲皮素對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的攻擊。

　　2.3  槲皮素對(duì)肉糜蛋白質(zhì)羰基含量的影響

　　蛋白質(zhì)羰基含量可作為蛋白質(zhì)氧化的一個(gè)重要指標(biāo)，羰基的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，主要是由活性氧導(dǎo)致肽鏈的斷裂及活性氧攻擊氨基酸分子的氨基或亞氨基產(chǎn)生，經(jīng)反應(yīng)最終生成NH3和相應(yīng)的羰基衍生物。羰基含量越高，蛋白質(zhì)氧化損傷的程度越高。由圖3可知，隨貯藏時(shí)間的延長，羰基含量不斷增加，貯藏第1～9天，空白組羰基含量由3.56nmol/mg上升到4.34 nmol/mg（P＜0.05），說明氧化促使蛋白側(cè)鏈羰基化進(jìn)程不斷加深。在貯藏1～6d時(shí)，除0.20g/kg槲皮素組的羰基含量顯著低于空白組外（P＜0.05），其他槲皮素組均與空白組差異不顯著（P＞0.05），說明槲皮素在較高添加量時(shí)能夠有效抑制蛋白質(zhì)氧化，其抑制效果歸因于B環(huán)上3’,4’-OH基團(tuán)對(duì)自由基的清除作用，含量越高則清除作用越強(qiáng)，這與Utrera等的研究結(jié)果一致。此外，槲皮素結(jié)構(gòu)中的5個(gè)酚羥基基團(tuán)和4-羰基結(jié)構(gòu)，能夠有效清除自由基，與金屬離子螯合也可以阻止蛋白羰基化過程，減少羰基化合物的生成，抑制蛋白質(zhì)氧化。

　　2.4  槲皮素對(duì)肉糜蛋白質(zhì)表面疏水性的影響

　　疏水相互作用對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性具有重大意義。疏水相互作用是一種非共價(jià)鍵相互作用，表面疏水性影響大分子間的相互作用，所以常用表面疏水性反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。一般用溴酚藍(lán)的結(jié)合量來表示表面疏水性的大小，蛋白質(zhì)疏水性氨基酸殘基結(jié)合的溴酚藍(lán)的量越大，表面疏水性就越高，則可說明內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露的就越多，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生的變化就越大。由圖4可知，隨貯藏時(shí)間延長，肌原纖維蛋白的表面疏水性呈上升狀態(tài)，這是由于蛋白質(zhì)被氧化導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化，促使內(nèi)部疏水性基團(tuán)暴露，表面疏水性不斷升高。貯藏第1天時(shí)，除0.20g/kg槲皮素組外，其他組的表面疏水性均顯著高于空白組（P＜0.05），這可能是由于少量槲皮素與蛋白相互作用，打開部分蛋白構(gòu)象，促進(jìn)了疏水性基團(tuán)的暴露，從而導(dǎo)致了表面疏水性增加。而在貯藏第3～9天時(shí)，除第6天添加量為0.05g/kg時(shí)的表面疏水性略高于空白組，其他各槲皮素組的表面疏水性均低于空白組，尤其是在第9天時(shí)，0.10、0.20g/kg槲皮素組的表面疏水性顯著低于空白組（P＜0.05），這是由于槲皮素可與蛋白質(zhì)疏水區(qū)域發(fā)生非共價(jià)結(jié)合，降低了溴酚藍(lán)與疏水基團(tuán)結(jié)合的幾率，表面疏水性降低；槲皮素還可通過與蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，形成巰基-醌或氨基-醌加成物，導(dǎo)致蛋白質(zhì)形成相互纏結(jié)的大分子聚集體，將疏水基團(tuán)掩蔽于其中；此外，蛋白質(zhì)分子之間也可能發(fā)生疏水相互作用形成聚集物，掩蓋原本的疏水位點(diǎn)，使表面疏水性降低。

　　注：同一指標(biāo)同列肩標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）；同行肩標(biāo)大寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。表2同。

　　肉及肉制品的顏色是消費(fèi)者對(duì)肉品質(zhì)量評(píng)估的主要依據(jù)，其顏色主要取決于肌肉中色素物質(zhì)肌紅蛋白和血紅蛋白的含量和變化狀態(tài)。由表1可知，貯藏第1天時(shí)，0.10、0.20g/kg槲皮素和BHA組的豬肉糜亮度（L*值）顯著高于空白組（P＜0.05），說明較高添加量的槲皮素對(duì)豬肉糜的亮度有提高作用。貯藏時(shí)間延長至第9天時(shí)，空白組的L*值高于槲皮素和BHA組，其可能的原因是槲皮素和BHA的添加有利于肉糜內(nèi)部水分的保持，從而降低水分表面滲出率，減弱光的反射程度，使L*值下降。

　　貯藏過程中，空白組肉糜的紅度（a*值）顯著下降（P＜0.05），這是由于豬肉糜中的肌紅蛋白和血紅蛋白氧化程度不斷加重，逐漸變?yōu)榧t褐色，促使肉糜顏色變暗。貯藏過程中，槲皮素和BHA組肉糜的a*值均高于空白組，其中效果最顯著的是0.10g/kg槲皮素組，這可能是由于槲皮素特有的酚羥基結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白競爭脂質(zhì)過氧化基團(tuán)，抑制肌紅蛋白氧化，從而穩(wěn)定豬肉糜的顏色。而槲皮素添加量為0.2g/kg時(shí)a*值降低，這主要是槲皮素本身顏色的影響所致。

　　2.6  槲皮素對(duì)肉糜蒸煮損失率的影響

　　蒸煮損失率能夠表征肌肉的保水性，主要反映生肉到熟肉的加熱過程中肉樣水分的流失情況，蒸煮損失率越大，則說明肉樣的保水性越差。由圖5可知，隨貯藏時(shí)間的延長，各組肉糜的蒸煮損失率也不斷升高，其中空白組蒸煮損失由25.02%顯著上升至貯藏末期的34.35%（P＜0.05）。這與余小領(lǐng)等的研究結(jié)果一致，可能的原因是隨貯藏時(shí)間的延長，肉中蛋白質(zhì)不斷溶出，分子不斷變小，使蛋白系水能力下降，從而導(dǎo)致蒸煮損失增加；此外，蛋白質(zhì)氧化破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中C＝O和N—H基團(tuán)與水分子之間的結(jié)合能力，氧化后凝膠網(wǎng)絡(luò)孔隙增多，使蛋白質(zhì)的水合作用有所降低，也會(huì)導(dǎo)致蒸煮損失增加。在貯藏1、3d時(shí)，所有處理組肉糜的蒸煮損失與空白組相比差異均不顯著（P＞0.05），說明貯藏初期，槲皮素與肉糜中蛋白質(zhì)的相互作用對(duì)其保水性的影響不明顯；貯藏第6、9天時(shí)，0.05g/kg和0.10g/kg槲皮素組肉糜的蒸煮損失率顯著低于空白組（P＜0.05），這可能是由于槲皮素與蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，起到“橋接”連接蛋白質(zhì)的作用，利于蛋白質(zhì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，從而增加了肉糜的系水能力；此外，適量槲皮素的加入能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)功能基團(tuán)的充分暴露，有利于熱凝膠形成過程中蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，也會(huì)提高肉糜的保水性。在整個(gè)貯藏過程中，0.20g/kg槲皮素組肉糜的蒸煮損失率略低于空白組，但差異一直不顯著（P＞0.05），說明槲皮素添加量過高反而不利于肉糜凝膠保水性的提高，這可能是由于過量的酚類物質(zhì)覆蓋在蛋白質(zhì)表面或與蛋白質(zhì)分子的過度結(jié)合，從而削弱了蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，不利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。

　　2.7  槲皮素對(duì)肉糜質(zhì)構(gòu)特性的影響

　　食品的質(zhì)構(gòu)特性是影響消費(fèi)者接受某種食品的重要因素之一。如表2所示，肉糜的質(zhì)構(gòu)特性分別由硬度、彈性、咀嚼度和回復(fù)性等指標(biāo)反映。在貯藏過程中，空白組的硬度顯著下降（P＜0.05），這可能是因?yàn)檠趸淖兞说鞍捉Y(jié)構(gòu)，使其形成凝膠能力變差，從而使肉糜的硬度下降。而槲皮素和BHA組的硬度、彈性、咀嚼度和回復(fù)性隨貯藏時(shí)間的延長，整體呈顯著上升趨勢(shì)（P＜0.05），說明槲皮素與BHA能通過抑制蛋白的氧化來阻止蛋白變性，從而有利于蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，改善肉糜的質(zhì)構(gòu)特性。貯藏第1天時(shí)，槲皮素組的硬度和咀嚼度均低于空白組；隨著貯藏時(shí)間的延長，槲皮素組的硬度、彈性和咀嚼度逐漸高于空白組，說明槲皮素與蛋白的充分結(jié)合增強(qiáng)了蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度，且槲皮素的多酚結(jié)構(gòu)能夠淬滅自由基，防止蛋白氧化產(chǎn)生的變性和裂解，使肉糜結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

　　隨冷藏時(shí)間的延長，空白組肉糜的脂肪和蛋白質(zhì)氧化程度不斷加深，TBARS值不斷增加，總巰基損失量、羰基含量和表面疏水性不斷增大，致使肉糜顏色變暗，蒸煮損失增大，肉糜硬度和彈性下降；而添加槲皮素后，能顯著減少TBARS的生成，降低脂肪氧化程度；高添加量的槲皮素對(duì)降低巰基損失、增加表面疏水性以及減少羰基化合物生成的效果較好；低添加量的槲皮素能有效保持肉糜色澤，降低肉糜的蒸煮損失；槲皮素能增加肉糜硬度和彈性等。因此，以槲皮素作為抗氧化劑時(shí)，應(yīng)選擇合適的添加量，使其不僅可起到抑制肉品氧化的作用，還可以改善肉品品質(zhì)特性。